李 森， 楊 焱， 黃小流， 駱小莉， 吳 迪， 李 覺

(1. 同濟大學醫(yī)學院，上海 200092； 2. 上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，國家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海 201106)

PM2.5是評估空氣污染嚴重程度的主要指標之一[1]，其沉積在肺泡中并通過肺泡毛細血管進入血流，導致慢性阻塞性肺病、肺癌及心血管疾病等風險增加。目前，國內(nèi)外大量體內(nèi)體外研究證實了PM2.5對呼吸系統(tǒng)[2]和心血管系統(tǒng)[3]的影響。但對PM2.5的探索已經(jīng)并不局限于此，最近的研究表明，PM2.5可以很容易地通過肺泡上皮細胞，進入循環(huán)系統(tǒng)，最終損害心血管系統(tǒng)和腎臟[4]。PM2.5誘導的氧化應激被認為是其造成腎功能損害的重要機制[5]，PM2.5暴露能夠改變抗氧化酶如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)、過氧化氫酶(catalase， CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)等表達，并降低它們的活性[6]。

桑黃在我國已有1300多年的歷史，是一種珍稀的藥用真菌[7]，桑黃菌絲體主要由多酚類化合物組成，具有抗炎、抗氧化作用，有助于改善血液循環(huán)、緩解胃痛、抗腫瘤、抗糖尿病和肺炎[8]。目前，對有效干預PM2.5所致腎損傷的作用研究尚無明確報道。本研究利用人工氣候環(huán)境暴露設(shè)備，以接近人體實際暴露途徑的方式評估亞慢性暴露于PM2.5對腎功能的影響以及桑黃的干預作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4周齡雄性SPF級SD大鼠，體重34～48g，購于上海杰斯捷實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于復旦大學公共衛(wèi)生學院上海市氣象與健康重點實驗室，于暴露前適應性飼養(yǎng)1周，所有動物實驗操作規(guī)范依據(jù)同濟大學醫(yī)學院實驗動物委員會文件(TJmed-010-10)執(zhí)行。

1.2 桑黃提取物

桑黃子實體及菌種由上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所提供，標本存放于上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所藥用真菌研究室。本研究所使用的桑黃提取物(Inonotus Sanghuang extract, ISE)是由桑黃Z子實體醇提取物與水提取物按質(zhì)量比1∶1混勻得到，在每天暴露前給予大鼠200mg/(kg·d)的ISE水懸液灌胃。

1.3 分組和暴露方案

PM2.5暴露采用由上海市氣象局長三角環(huán)境氣象預報預警中心研發(fā)的人工氣候環(huán)境暴露倉(型號：Shanghai-MR-TAS)，實驗動物以自然吸入的方式實現(xiàn)全身暴露[9]。將30只SD大鼠隨機分為3組(n=10)，對照組(filtered air， FA)置于對照倉以接受過濾后的清潔空氣，暴露組(concentrated ambient PM2.5， PM組)和暴露干預組(inonotus Sanghuang， ISE組)置于暴露倉以接受濃縮后的高濃度顆粒物空氣。暴露期間保持室溫(20～25℃)和相對濕度(40%～ 70%)，進行12h∶12h的光/暗循環(huán)，提供足夠的清潔飲用水和標準飼料。暴露方案連續(xù)進行12周(2018年11月—2019年1月)，每周5d，每天8～10h。每周選取1d將大鼠置于代謝籠(江蘇賽昂斯生物科技公司)中，收集24h尿液，計算單位時間的尿流率[10]，并根據(jù)大鼠體重調(diào)整數(shù)據(jù)。暴露期間，每天記錄對照倉、濃縮倉和室外環(huán)境顆粒物濃度。

1.4 樣品采集

最后一次暴露后收集大鼠尿液，在4℃下以離心半徑16cm，1500r/min，離心10min。取上清液于-80℃下保存。將大鼠頸椎脫臼處死后，用心臟穿刺法抽取血液，4℃下離心后取血清保存于-80℃，用于血清學檢測。摘取兩側(cè)腎組織，去除筋膜后用預冷的PBS清洗，擠壓去除多余的血液?？v向切取大小適中的組織置于4%的多聚甲醛中固定，脫水、包埋、切片并進行蘇木精-伊紅染色(H-E染色)，高倍顯微鏡下觀察各組腎臟病理變化。其余腎臟組織放入液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃保存，用于檢測氧化應激及腎損傷指標。

1.5 腎功能參數(shù)

使用羅氏生化自動分析儀(Roche， Cobas 8000)檢測大鼠的血清肌酐(serum creatinine， Scr)、血清尿素氮(blood urea nitrogen， BUN)和尿肌酐(urine creatinine， Ucr)含量，并按照以下公式估算腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate， eGFR)[10]：

eGFR=尿流率[μL/(min·100g)]×[尿肌酐(mg·mL-1)/血清肌酐(mg·mL-1)]。

1.6 腎損傷和氧化應激標志物的檢測

使用ELISA試劑盒檢測大鼠血清中胱抑素C和尿液中β2微球蛋白的含量以評估大鼠腎功能的情況，ELISA試劑盒購于上海晶抗生物工程有限公司。使用丙二醛(malonaldehyde， MDA)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)、總谷胱甘肽(total glutathione， T-GSH)檢測試劑盒檢測MDA、SOD及T-GSH的表達水平或活性，試劑盒均購自于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 暴露情況

在大鼠暴露期間，對照倉中的PM2.5的濃度為8.24μg/m3(4.52～13.54μg/m3)，暴露倉中平均濃度為255.71μg/m3(72.15～596.84μg/m3)，室外環(huán)境中平均濃度為41.48μg/m3(19.2～83.8μg/m3)，暴露倉中顆粒物的平均濃縮倍數(shù)為室外環(huán)境的6.16倍(2.91～13.69倍)，見圖1。

圖1 暴露期間PM2.5平均濃度Fig.1 Average concentration of PM2.5 during exposureto PM2.5

2.2 暴露過程中各組大鼠尿流率的比較

從暴露的第3周開始，PM組大鼠的尿流率顯著高于FA組(P<0.05)，并在第8、9、11、12周出現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)。ISE組與PM組相比，第8、9、11、12周大鼠尿流率顯著降低。與FA組相比，ISE組大鼠尿流率雖然有升高但差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 暴露期間各組大鼠尿流率的比較

周FA組PM組ISE組14.19±1.653.94±2.374.09±2.7323.54±1.784.33±1.884.34±2.335.34±1.68.4±3.75*6.77±3.4444.67±1.886.54±2.01*5.71±2.2955.65±1.647.45±1.81*6.81±2.8464.31±1.166.33±2.55*5.4±2.3973.58±0.865.37±2.37*3.94±1.9483.73±1.275.96±2.08**3.99±1.96#93.19±0.875.33±2.40**3.36±1.44#103.27±0.884.97±1.90*3.76±1.74113.39±0.815.19±1.85**2.75±1.35##123.11±1.144.6±1.83**3.19±0.93##

與FA組相比，*P<0.05，**P<0.01；與PM組相比，#P<0.05，##P<0.01

2.3 腎功能指標和腎損傷標志物

經(jīng)過12周的PM2.5暴露，PM組相對于FA組大鼠Scr(P=0.014)和BUN(P=0.011)濃度顯著升高，而eGFR(P=0.003)水平明顯降低；ISE組Scr和BUN(P=0.013)濃度低于PM組，而eGFR(P=0.009)水平高于PM組，其中后兩者差異具有統(tǒng)計學意義，見表2。進一步分析腎損傷的標志物結(jié)果表明，PM組大鼠尿液中β2-MG濃度高于FA組(P=0.02)，ISE組β2-MG濃度較PM組明顯降(P=0.002)，與FA組持平，見圖2A;同時，PM組血清中Cys-C的濃度顯著高于FA組(P=0.018)，而ISE組Cys-C濃度較PM組降低，差異具有邊際效應(P=0.051)，與FA組相比無明顯變化，見圖2B。

2.4 大鼠腎臟組織病理學變化

各組大鼠腎臟病理切片H-E染色顯示，PM組大鼠正常的腎小管結(jié)構(gòu)破壞，可見腎小管空泡變性，上皮細胞水腫和輕微的管間免疫細胞浸潤，但腎小球損傷較輕。ISE組較PM組大鼠腎組織損傷明顯減輕，腎小管結(jié)構(gòu)基本正常，腎小球細胞略有增多，見圖3。

表2 暴露后大鼠腎臟和血清學參數(shù)

組別Scr/(mg·L-1)BUN/(mmol·L-1)eGFR/[μL·(min·100g)-1]FA23.03±3.544.22±0.70875.32±86.13PM26.91±1.48*4.97±0.65*757.45±69.30**ISE24.34±2.584.23±0.30#859.3±85.03##

與FA組相比，*P<0.05，**P<0.01；與PM組相比，#P<0.05，##P<0.01

圖2 暴露后各組大鼠尿液和血清中腎損傷標志物的含量Fig.2 Contents of kidney damage markers in urine and serum of rats與FA組相比，*P<0.05，與PM組相比，#P<0.05

圖3 各組大鼠腎臟組織病理檢查結(jié)果(H-E，×200)Fig.3 The pathological results of kidney in rats(H-E，×200)

2.5 大鼠血清和腎組織中氧化應激情況

暴露12周后，PM組腎組織和血清中氧化應激標志物MDA(P=0.004，P=0.002)水平較FA組明顯升高，抗氧化應激標志物SOD(P=0.003,P=0.0003)和T-GSH(P=0.001，P=0.002)水平降低。ISE組與PM組相比，腎組織和血清中MDA(P=0.016，P=0.002)水平顯著降低，而T-GSH(P=0.029，P=0.038)水平顯著升高。ISE組與FA組相比，只有血清中SOD(P=0.031)水平低于FA組，見圖4。

圖4 暴露PM2.5后大鼠腎組織和血清中MDA、SOD和T-GSH水平Fig.4 Levels of MDA、 SOD and T-GSH in kidney tissues and serum after exposureto PM2.5與FA組相比，*P<0.05，**P<0.01，與PM組相比，#P<0.05，##P<0.01

3 討 論

目前大多數(shù)研究主要是關(guān)注短期急性PM2.5暴露導致的腎損傷。本研究使用SD大鼠來觀察亞慢性暴露于PM2.5誘導的腎臟損傷并研究ISE的干預作用。本研究使用的氣候環(huán)境暴露設(shè)備，采用旋風切割和富集式濃縮的方式使顆粒物達到較理想的濃縮效果，并且最大限度保留了PM2.5濃縮前的化學特性，動物自然吸入PM2.5完成暴露，突破了滴入式染毒法的局限性，使暴露過程更接近人體真實的暴露方式[11]。

在持續(xù)12周的暴露過程中，PM組大鼠的尿流率從第3周到暴露結(jié)束均顯著高于FA組，這種持續(xù)性多尿現(xiàn)象，一方面可能是因為PM2.5環(huán)境的直接作用，PM2.5具有吸濕特性，使氣道內(nèi)水分流失，從而刺激口渴和飲水，引起尿量增加；另一方面與PM2.5誘導腎小管損傷，導致濃縮功能受損有關(guān)，PM組大鼠腎組織H-E染色顯示腎小管上皮細胞水腫及輕微管腔閉塞。而對于ISE組，同樣是從第3周開始，其尿流率一直略高于FA組，但從第8周起顯著低于PM組。我們猜測可能是ISE持續(xù)作用一段時間后，減輕了PM2.5暴露導致的腎小管損傷，逐漸提高了尿濃縮能力。在暴露后進行的尿液和血清生化檢查，結(jié)果支持本研究的假設(shè)，PM2.5暴露導致腎小球功能下降，但在PM2.5暴露的同時使用ISE干預，則產(chǎn)生了有效的保護作用。考慮到通過測量Scr和eGFR水平對腎臟損傷情況進行評價的方法并不是十分可靠[12]，本研究繼續(xù)檢測了腎損傷敏感的生物標志物血清Cys-C和尿液β2-MG，它們分別代表腎小球和腎小管損傷[13]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PM組Cys-C和β2-MG水平均顯著升高，而ISE組尿液β2-MG水平較PM組明顯降低，這從分子層面說明ISE減輕了PM2.5介導的腎臟損傷。

PM2.5引起的腎損傷很大程度上可解釋為氧化應激的結(jié)果[5]。PM2.5暴露后，PM組大鼠血清和腎組織中MDA水平的升高以及T-GSH和SOD活力的降低證實了氧化應激的激活。而與PM組相比，ISE組大鼠血清和腎組織中MDA水平顯著降低以及T-GSH和SOD水平的升高說明ISE顯著抑制了PM2.5誘導的系統(tǒng)性氧化應激反應。本研究中使用的ISE由多種復雜的多糖和多酚類化合物組成，其中的槲皮素、綠原酸等多酚類化合物已被證明具有良好的抗氧化、抗增殖、抗炎和抗微生物活性[14-15]。

總之，本研究結(jié)果表明，亞慢性PM2.5暴露激活了氧化應激反應，導致SD大鼠腎小管和腎小球損傷，從而引起腎功能下降。而ISE的干預抑制腎臟的氧化應激反應，減輕了PM2.5暴露誘導的腎功能損傷。初步推定ISE通過發(fā)揮其抗氧化能力具有改善PM2.5致腎損傷的保護作用，不過，此過程中ISE抑制氧化應激的作用途徑和確切機制以及其發(fā)揮作用的劑量和有效成分，還需要在細胞和分子水平上進行深入研究以進一步闡明。