孫娜娜，劉金虎，楊孟迪，徐丹，徐秦峰

(陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院國家羊乳制品加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，西安710021)

0 引言

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種具有抗菌、抗病毒、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種生物活性的鐵結(jié)合糖蛋白，分子量約為80 ku[1-2]。2012年我國將乳鐵蛋白列入營養(yǎng)強(qiáng)化劑[3]可添加至嬰幼兒配方奶粉中，使其更成分更接近母乳，增加營養(yǎng)價值。相關(guān)研究表明，乳鐵蛋白對嬰幼兒貧血、腹瀉以及降低新生兒敗血癥等具有重要的輔助和治療作用[4]。大量的研究表明，熱處理程度不同，乳鐵蛋白的變性程度存在差異[2,5]，但為保證液態(tài)乳的安全性和質(zhì)量，在生產(chǎn)過程中必須進(jìn)行熱殺菌工藝。因此，精準(zhǔn)的熱處理工藝，不僅可以保證牛乳的食用安全，同時又能最大程度地保留牛奶中的天然活性蛋白，提高牛奶的營養(yǎng)價值。乳鐵蛋白含量作為優(yōu)質(zhì)巴氏殺菌乳的重要評價指標(biāo)[6-7]，乳鐵蛋白的準(zhǔn)確、快速定量對優(yōu)質(zhì)乳的生產(chǎn)工藝控制以及嬰幼兒奶粉營養(yǎng)價值評估具有重要的參考意義。

目前，常見的乳鐵蛋白的檢測方法有高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、液相色譜-質(zhì)譜法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法等[7-8]。由于乳制品中乳鐵蛋白豐度較低且乳制品成分復(fù)雜，我國尚未建立乳及其制品中乳鐵蛋白檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)[9]，高效液相色譜由于其高靈敏度和特異性[10-16]，作為乳鐵蛋白檢測最常用的方法，僅適用于乳鐵蛋白含量較高的樣品，團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/TDSTIA 006-2019《奶及奶制品中乳鐵蛋白的測定液相色譜法》用于乳制品中乳鐵蛋白的定量檢測，通過磷酸鹽提取、肝素親和柱富集后進(jìn)行高效液相色譜法檢測[17]，前處理過程繁瑣且成本較高。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，通過內(nèi)標(biāo)法增加了檢測的準(zhǔn)確性，但不可避免的胰蛋白酶水解尋找特異性肽段的過程時間較長且整個檢測過程對操作人員的專業(yè)素養(yǎng)要求較高[18-21]。酶聯(lián)免疫法靈敏度高但檢測時需要逐級稀釋確保檢測結(jié)果有效所以重現(xiàn)性較差[22-23]。毛細(xì)管區(qū)帶電泳法靈敏度高，但為抑制蛋白吸附，提高檢測的準(zhǔn)確性，需要對毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行涂層處理。Li Jia[24]通過添加非離子表面活性劑Brij35抑制毛細(xì)管內(nèi)壁對LF的吸附作用，結(jié)合紫外檢測器實現(xiàn)了LF的定量檢測。Mao ke[25]等通過熱致聚（2-甲基-2-噁唑琳）涂層實現(xiàn)了嬰幼兒奶粉中LF的毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析?；谏鲜龇椒ǖ膬?yōu)缺點，建立前處理簡單、快速、準(zhǔn)確的LF檢測方法仍然是乳制品企業(yè)用于乳制品質(zhì)量評估以及熱處理工藝控制的不懈追求。

本研究通過篩選的適配體和LF的特異性結(jié)合，經(jīng)全自動毛細(xì)管凝膠電泳分析后游離適配體的峰面積的減少以及減少程度實現(xiàn)乳鐵蛋白的定性定量檢測。避免了前期研究通過聚丙烯酰胺[26]和瓊脂糖凝膠電泳[27-28]檢測乳鐵蛋白的制膠、點樣、灰度讀取等耗時、繁復(fù)的流程，相比Zhu chao[29]等建立的乳鐵蛋白的毛細(xì)管區(qū)帶電泳-適配體傳感器檢測方法，具有分析時間更短、自動化程度高的優(yōu)點，為乳制品企業(yè)檢測LF提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DNA序列（5’-(FAM)-AGG CAG GAC ACC GTA ACC GGT GCA TCT ATG GCT ACT AGC TCT TCC TGC CT-3’）由上海生工生物工程公司合成，DL500 bp DNA marker（Takara），各蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、100×TE緩沖液以及磷酸鹽緩沖液PBS（Sigma-Aldrich），20 bp DNA Marker、1 000 bp DNA Marker、高分辨卡夾S1（High Resolution Cartridge）、標(biāo)準(zhǔn)卡夾S2（Standard Cartridge）以及快速卡夾F3（Fast Cartridge）均來自臺灣光鼎（Bioptic）公司。

5424R高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf有限公司；QSEP 100 Advance全自動核酸分析儀，臺灣Bioptic公司；DK-8D電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設(shè)備有限公司，MYSPIN 12微型離心機(jī)，Thermo Fisher Scientific；Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司。

1.2 實驗材料

實驗中所用到的生牛乳來源學(xué)校附近散戶售賣處，巴氏乳、全脂牛乳以及嬰幼兒固體奶粉購于西安市某超市，液態(tài)奶樣品冰箱4℃儲存待用，奶粉樣品常溫儲存待用。

1.3 檢測方法

實驗中的DNA序列由1×TE緩沖液溶解至100 μmol/L，1×PBS（pH為7.4時，NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO4·12H2O 10 mmol/L,KH2PO42 mmol/L）稀釋至1μmol/L。為獲得具有功能性的DNA序列的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，使用前對DNA序列進(jìn)行95±0.5℃，5 min退火處理，冰箱-20℃下2 min冷卻待用。

全自動毛細(xì)管凝膠電泳檢測參數(shù)為：LED激發(fā)光源：480 nm；檢測器：PMT熒光檢測器；進(jìn)樣電壓：4 k V；進(jìn)樣時間：10 s；分離電壓：8 k V；分離時間：240 s；毛細(xì)管的有效分離長度為13 cm。

1.4 可行性驗證

2.5μL乳鐵蛋白（100μg/mL）、5.0μL FAM-DNA序列、2.5μL（100μg/mL）乳鐵蛋白和5.0μL FAMDNA序列的混合物中分別加入1.0μL 20×PBS，加入超純水至最終體系為20μL，混勻孵育30 min后進(jìn)行全自動毛細(xì)管凝膠電泳檢測和瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 毛細(xì)管凝膠電泳檢測參數(shù)對實驗的影響

1.5.1 進(jìn)樣時間對檢測的影響

5.0μL FAM-DNA序列中加入2.0μL的乳鐵蛋白（100μg/mL），加入1.0μL的20×PBS，加入超純水至終體系為20μL，混勻孵育30 min。設(shè)置進(jìn)樣時間分別為10、15、30、45、60 s，進(jìn)行全自動毛細(xì)管凝膠電泳檢測。

1.5.2 卡夾類型和分離電壓對檢測的影響

FAM-DNA序列5.0μL中加入2.0μL的乳鐵蛋白（100μg/mL），1.0μL的20×PBS，加入超純水至終體系為20μL，混勻孵育30 min。改變分離卡夾類型以及分離電壓，進(jìn)行全自動毛細(xì)管凝膠電泳檢測。

1.6 靈敏度檢測

5.0μL FAM-DNA序列中分別加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μL的乳鐵蛋白（100μg/mL），加入1.0μL 20×PBS后加超純水使得最終體系為20μL，混勻孵育30 min，進(jìn)行全自動毛細(xì)管凝膠電泳檢測。

1.7 特異性驗證

5.0μL FAM-DNA序列中分別加入2.0μL乳鐵蛋白（100μg/mL）、4.0μL（100μg/mL）乳制品中常見的干擾蛋白α-乳白蛋白（α-Lac，α-lactabumin）、β-乳球蛋白（β-LG,β-lactoglobulin）、酪蛋白（Casein）以及設(shè)置空白對照（Buffer），加入1.0μL 20×PBS，加超純水使得最終體系為20μL，混勻孵育30 min，進(jìn)行全自動毛細(xì)管凝膠電泳檢測。

1.8 實際樣品檢測

5.0μL FAM-DNA序列中分別加入巴氏乳2.0μL、全脂牛乳2.0μL、生牛乳1.0μL，嬰幼兒奶粉（含乳鐵蛋白）3.0μL、嬰幼兒奶粉（不含乳鐵蛋白）3.0μL，對于加標(biāo)樣品，加入1.0μL乳鐵蛋白（100μg/mL），各加入1.0μL 20×PBS后加超純水使得最終體系為20μL，混勻孵育30 min，進(jìn)行全自動毛細(xì)管凝膠電泳檢測（嬰幼兒奶粉溶解方式為稱取1 g奶粉用超純水定容至7 mL）。

2 結(jié)果與討論

2.1 毛細(xì)管凝膠電泳檢測乳鐵蛋白的可行性驗證

毛細(xì)管凝膠電泳通過在電場作用下各DNA片段長度差異導(dǎo)致電泳遷移率不同，實現(xiàn)樣品中的DNA片段分離，根據(jù)各DNA片段出峰時間以及分離后峰面積差異實現(xiàn)DNA片段的定性、定量。適配體[30]是可以高親和力和特異性識別目標(biāo)物質(zhì)的一段DNA或者RNA序列，目標(biāo)物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、金屬離子、小分子等。本研究通過許丹科[31]等篩選的乳鐵蛋白Lac-A4序列適配體和LF的特異性結(jié)合，經(jīng)全自動毛細(xì)管凝膠電泳分析后游離適配體的峰面積的減少實現(xiàn)乳鐵蛋白的定性定量檢測。

將LF、FAM-DNA+LF以及FAM-DNA樣品在結(jié)合緩沖液中孵育后使用標(biāo)準(zhǔn)卡夾（S2，8 kV）進(jìn)行全自動毛細(xì)管凝膠電泳檢測，驗證方法的可行性。結(jié)果如圖1（a）所示，F(xiàn)AM-DNA+LF、FAM-DNA樣品均在61 s處出現(xiàn)DNA序列的峰，由于FAM-DNA和乳鐵蛋白的特異性結(jié)合，導(dǎo)致含乳鐵蛋白的陽性樣品游離DNA的信號和峰面積大小明顯低于不含乳鐵蛋白的陰性樣品，單獨的LF樣品未觀察到明顯的電泳信號。圖1（b）瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果表明DNA序列確實能和LF發(fā)生特異性結(jié)合，生成滯后的DNA-LF復(fù)合物條帶，導(dǎo)致未結(jié)合的DNA序列灰度值降低，驗證了本研究通過全自動毛細(xì)管凝膠電泳利用FAM-DNA序列和乳鐵蛋白的特異性結(jié)合，導(dǎo)致峰面積減少對乳鐵蛋白進(jìn)行定性定量檢測的可行性。

圖1 全自動凝膠電泳檢測乳鐵蛋白的可行性驗證

全自動毛細(xì)管凝膠電泳結(jié)果未能觀察到DNA和LF結(jié)合的復(fù)合物峰，可能是由于LF分子量較大，全自動毛細(xì)管凝膠電泳采用電動進(jìn)樣，存在進(jìn)樣歧視，樣品的進(jìn)樣時間太短導(dǎo)致LF-DNA復(fù)合物未能進(jìn)入檢測，所以未出現(xiàn)LF-DNA復(fù)合物的峰。因此通過增加進(jìn)樣時間觀察能否出現(xiàn)復(fù)合物的峰。結(jié)果如表1所示，隨著進(jìn)樣時間的增加，樣品的進(jìn)樣量增加，游離DNA的峰面積增加，但未能發(fā)現(xiàn)復(fù)合物的峰。

表1 進(jìn)樣時間對檢測結(jié)果的影響

不同類型的卡夾的最佳分辨率和分離電壓不同，電泳緩沖液也可能不同。猜測上述卡夾類型和分離電壓導(dǎo)致未能發(fā)現(xiàn)復(fù)合物的峰，因此選用Bioptic公司中常見的高分辨率卡夾（S1，6 k V）、標(biāo)準(zhǔn)卡夾（S2，8 k V和10 k V）以及快速卡夾（F3，13 k V）分別對含乳鐵蛋白的陽性樣品進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳檢測，結(jié)果如表2所示。改變不同的卡夾和分離電壓，均在靠近20 bp DNA Marker附近發(fā)現(xiàn)游離DNA的峰。但仍未能發(fā)現(xiàn)LF-DNA復(fù)合物的峰。

表2 分離卡夾以及分離電壓對檢測結(jié)果的影響

上述的研究表明通過改變進(jìn)樣時間、卡夾類型和分離電壓，均未能指示LF-DNA復(fù)合物的峰。通過查閱毛細(xì)管凝膠電泳分析DNA和蛋白質(zhì)相互作用的相關(guān)文獻(xiàn)，Hu Jiaming等[32]利用游離適配體DNA電泳峰面積的減少對適配體DNA的解離常數(shù)進(jìn)行測定，此文獻(xiàn)中強(qiáng)調(diào)了采用的是非變性凝膠，因此推測實驗中未能觀察到復(fù)合物電泳峰，最大的可能是所用的卡夾凝膠中包含變性劑(卡夾中分離凝膠緩沖液詳細(xì)信息未知)，影響蛋白質(zhì)進(jìn)入毛細(xì)管，從而影響復(fù)合物出峰。而圖1（b）瓊脂糖凝膠電泳能清晰的觀察到LF-DNA復(fù)合物的峰，主要是因為凝膠和電泳緩沖液中不包含變性劑，而且凝膠本身也對DNA-蛋白質(zhì)的結(jié)合有穩(wěn)定作用[33]。再者，Hu Jiaming[32]等人通過對凝血酶和DNA適配體的全自動毛細(xì)管相互作用的研究表明，采用游離DNA峰面積的減少進(jìn)行定量檢測時誤差更少，因此本實驗可以根據(jù)不同濃度的乳鐵蛋白和DNA結(jié)合后，游離DNA的峰面積變化對乳鐵蛋白進(jìn)行定量。

2.2 靈敏度實驗

為了驗證所建立的全自動高通量毛細(xì)管凝膠電泳方法可以用于乳及其制品中乳鐵蛋白的定量檢測，將濃度梯度的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分別和FAM-DNA序列孵育，結(jié)合緩沖液做空白對照，使用標(biāo)準(zhǔn)卡夾（S2，8 k V）進(jìn)行全自動毛細(xì)管凝膠電泳檢測，隨著乳鐵蛋白的增加，導(dǎo)致更多的乳鐵蛋白和FAM-DNA發(fā)生特異性結(jié)合，因此游離的DNA序列減少，產(chǎn)生的峰面積降低如圖2（a）所示。

以乳鐵蛋白的濃度（nmol/L）為橫坐標(biāo)，游離DNA序列的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=-21.6784x+10735.16667，R2=0.96051，如圖2（b）。結(jié)果表明該方法可以用于乳鐵蛋白的定量檢測并且呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖2 不同濃度乳鐵蛋白的全自動毛細(xì)管凝膠電泳圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 特異性驗證

為排除乳及其制品中常見的干擾蛋白如α-乳白蛋白（α-Lac）、β-乳球蛋白（β-LG）、酪蛋白（Cas）和FAM-DNA序列的非特異性結(jié)合，影響對乳鐵蛋白（LF）檢測的準(zhǔn)確性。將FAM-DNA序列和不同蛋白孵育后，使用標(biāo)準(zhǔn)卡夾（S2，8 k V）進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳檢測。結(jié)果如圖3所示：只有含LF的樣品和DNA特異性結(jié)合使得游離DNA的峰面積明顯減少，表明只有乳鐵蛋白和FAM-DNA序列發(fā)生了特異性結(jié)合，導(dǎo)致游離DNA峰面積減少。因此可以通過毛細(xì)管凝膠電泳后游離DNA峰面積的減少，實現(xiàn)乳鐵蛋白的特異性檢測。

圖3 全自動毛細(xì)管凝膠電泳檢測乳鐵蛋白的特異性

2.4 實際樣品檢測

為驗證本研究建立的全自動毛細(xì)管凝膠電泳法檢測乳鐵蛋白的實用性，采用上述方法對市售的5種乳及其制品（生牛乳、全脂牛乳、巴氏殺菌乳、不含乳鐵蛋白的嬰幼兒奶粉、含乳鐵蛋白的嬰幼兒奶粉）中乳鐵蛋白含量進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果如表3所示。陽性奶粉檢測值為27.7 mg/100 g(標(biāo)示值為30 mg/100 g)，與標(biāo)簽值接近且加標(biāo)回收率為97.8%，陰性奶粉樣品未檢出。生牛乳中乳鐵蛋白的檢測量在0.02～0.35 mg/mL[34]范圍內(nèi)且高于巴氏乳和全脂牛乳，與預(yù)期相符。表明本研究建立的毛細(xì)管凝膠電泳操作簡單、全自動即可用于乳及其制品中乳鐵蛋白的定量檢測。為企業(yè)優(yōu)質(zhì)乳的生產(chǎn)工藝控制以及嬰幼兒奶粉營養(yǎng)價值評價提供一定的技術(shù)參考。

表3 實際樣品中乳鐵蛋白的檢測結(jié)果

3 結(jié)論

乳鐵蛋白作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到許多嬰幼兒奶粉中提高嬰幼兒奶粉的營養(yǎng)價值；乳鐵蛋白的含量作為優(yōu)質(zhì)巴氏殺菌乳的重要評價指標(biāo)。因此建立乳及乳制品中乳鐵蛋白的簡便快速、低成本、高通量的檢測方法十分重要，其不僅可以對液態(tài)乳的生產(chǎn)工藝進(jìn)行精準(zhǔn)控制，也可對嬰幼兒奶粉的營養(yǎng)價值進(jìn)行評估。本研究利用DNA序列和LF的特異性結(jié)合，基于游離DNA序列的峰面積大小和乳鐵蛋白的濃度呈現(xiàn)的良好線性關(guān)系建立了一種操作簡單、快速、準(zhǔn)確的乳及其制品中乳鐵蛋白的全自動毛細(xì)管凝膠電泳定性定量檢測方法。采用預(yù)制膠卡夾避免毛細(xì)管區(qū)帶電泳需要涂層抑制非特異性吸附的困境，也無需傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳繁瑣的制膠、點樣、灰度讀取等過程。對液態(tài)乳生產(chǎn)加工工藝控制以及嬰幼兒奶粉營養(yǎng)評估提供技術(shù)支持。