黃嬌

摘要：比較水質(zhì)分析中酶底物法、紙片快速法這兩種不同方法對總大腸菌群的檢測效果。對2個有證標(biāo)準(zhǔn)樣品（3 100 MPN/L和3 700 MPN/L）進(jìn)行檢測，考察上述兩種方法的準(zhǔn)確度;對低（400 MPN/L）、中（1.0×104 MPN/L）、高（3.0×106 MPN/L）3個細(xì)菌總數(shù)濃度樣品進(jìn)行檢測，考察兩種方法的適用性。結(jié)果表明：酶底物法的準(zhǔn)確度更高;酶底物法適用于低中濃度細(xì)菌水樣，紙片快速法適用于高濃度細(xì)菌水樣?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度要求和不同水質(zhì)污染程度選取合適的方法，以滿足水質(zhì)分析要求。

關(guān)鍵詞：水質(zhì);總大腸菌群;檢測方法;酶底物法;紙片快速法

中圖分類號：R123.1? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? 文章編號：1674-1161（2020）03-0033-03

微生物檢測是水質(zhì)環(huán)境監(jiān)測的重要檢測手段。在水質(zhì)衛(wèi)生質(zhì)量評價和控制中，通常采用大腸桿菌作為指示菌，通過對指示菌的檢測和控制來了解水體的受污染狀況，從而評價其質(zhì)量，以保證衛(wèi)生安全。因此，需要探索、建立快速檢測大腸桿菌的新方法。本課題對實(shí)驗(yàn)室常用的兩種總大腸菌群檢測方法——酶底物法和紙片快速法進(jìn)行比較，考察方法的準(zhǔn)確性及適用性，以期為有針對性地選取合適的檢測方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

有證標(biāo)準(zhǔn)樣品3 100 MPN/L和3 700 MPN/L;低濃度（400 MPN/L）、中濃度（1.0×104 MPN/L）、高濃度（3.0×106 MPN/L）實(shí)際細(xì)菌水樣;科立得Colilert酶底物法24 h試劑：美國愛德士公司;LCHJ755型系列（A）水質(zhì)總大腸菌群快速測定紙片：廣州力測生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LX-B75L型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器;BOXUN SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱;SEA Instrument Ouantitative sealing machine自動封口儀;97孔定量盤。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酶底物法 無需在無菌室操作，可佩戴口罩、點(diǎn)酒精燈進(jìn)行操作。1） 樣品稀釋。樣品采集后2 h內(nèi)檢測，或在10 ℃以下冷藏不超過6 h。根據(jù)樣品污染程度確定接種量，避免接種樣品培養(yǎng)后97孔定量盤出現(xiàn)全部陽性或全部陰性。2） 接種。量取100 mL樣品或稀釋樣品于滅菌后的三角瓶，加入2.7±0.5 g培養(yǎng)基粉末，充分混勻溶解后，全部倒入97孔盤內(nèi)，以手撫平97孔定量盤背面，趕除孔內(nèi)氣泡，然后用定量封口機(jī)封口。觀察97孔定量盤顏色，若出現(xiàn)類似或深于標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤的顏色，則需排查樣品、培養(yǎng)基、無菌水等一系列因素后，終止試驗(yàn)或重新操作。3） 培養(yǎng)。將封口后的97孔定量盤放入恒溫培養(yǎng)箱中37±1 ℃下培養(yǎng)24 h。4） 結(jié)果判讀與計數(shù)。將培養(yǎng)24 h后的97孔定量盤進(jìn)行結(jié)果判讀，樣品變黃色判斷為總大腸菌群陽性，參見最大可能數(shù)MPN表分別記錄97孔定量盤中大孔和小孔的陽性孔數(shù)量。5） 結(jié)果計算。從97孔定量盤法MPN表中查得每100 mL樣品中總大腸桿菌群數(shù)的MPN值后，根據(jù)樣品不同的稀釋度，換算樣品中總大腸菌群濃度。計算公式為：

C=MPN值×1 000/f

式中：C為樣品中總大腸菌群濃度，MPN/L;MPN值為每100 mL樣品中總大腸菌群濃度，MPN/100 mL;1 000為將C的單位由MPN/mL轉(zhuǎn)換為MPN/L;f為最大接種量，mL。

1.3.2 紙片快速法 所有操作均在無菌室進(jìn)行。1） 接種細(xì)菌水樣前準(zhǔn)備。樣品采集后2 h內(nèi)檢測，或在10 ℃以下冷藏不超過6 h。當(dāng)每張紙片的接種量為10 mL或1 mL時，充分混勻水樣備用;當(dāng)每張紙片接種量為0.1 mL時，先制成1∶10的稀釋水樣。2） 接種。10 mL水樣量紙片5張，各接種10 mL水樣;1 mL水樣量紙片10張，其中5張各接種1 mL水樣，另外5張各接種1∶10的稀釋水樣1 mL。接種水樣應(yīng)均勻滴在紙片上，待紙片充分浸潤、吸收水樣，用水在聚丙烯塑膜外側(cè)輕輕撫平，做好標(biāo)記。3） 培養(yǎng)。在37±1 ℃的條件下培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果。4） 結(jié)果判讀。紙片上出現(xiàn)紅斑或紅暈，且周圍變黃為陽性;紙片全片變黃，無紅斑或紅暈為陽性;紙片部分變黃，無紅斑或紅暈為陰性;紙片的紫色背景上出現(xiàn)紅斑或紅暈，而周圍不變色為陰性;紙片無變化為陰性。5） 結(jié)果計算。根據(jù)不同接種量的陽性紙片數(shù)量，查MPN表得到MPN值（MPN/100 mL），換算并報告1 L水樣中總大腸菌群數(shù)。計算公式為：

C=100×M/Q

式中：C為水樣總大腸菌群濃度，MPN/L;M為查MPN表得到的MPN值，MPN/100 mL;Q為實(shí)際細(xì)菌水樣最大接種量，mL;100為10×10 mL，其中10為將MPN值的單位MPN/100 mL轉(zhuǎn)化為MPN/L，10 mL為MPN表中最大接種量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

檢測結(jié)果全部經(jīng)對數(shù)（以10為底）轉(zhuǎn)換后進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品兩種方法準(zhǔn)確度對比

標(biāo)樣1為證書標(biāo)準(zhǔn)值3 100 MPN/L的標(biāo)準(zhǔn)樣品，標(biāo)樣2為證書標(biāo)準(zhǔn)值3 700 MPN/L的標(biāo)準(zhǔn)樣品。A表示采用酶底物法，B表示采用紙片快速法。對同一標(biāo)準(zhǔn)樣品分別采用兩種方法平行檢測6次，計算RSD值，結(jié)果見表1。

由表1可知：檢測同一標(biāo)準(zhǔn)樣品，酶底物法的RSD值小于紙片快速法，說明酶底物法檢測準(zhǔn)確度優(yōu)于紙片快速法。查最大可能數(shù)MPN表，酶底物法的最低檢出限為10 MPN/L，紙片快速法為20 MPN/L，可見酶底物法檢出限低，優(yōu)于紙片快速法。

2.2 不同濃度樣品兩種方法準(zhǔn)確度比對

對低濃度（400 MPN/L）、中濃度（1.0×104 MPN/L）、高濃度（3.0×106 MPN/L）實(shí)際細(xì)菌水樣分別采用兩種方法平行檢測6次，計算RSD值，結(jié)果見表2。

由表2可知：檢測低、中濃度細(xì)菌水樣，酶底物法的RSD值較小，準(zhǔn)確度更高;高濃度細(xì)菌水樣在濃度超過24 000 MPN/L時，兩種方法均無法計數(shù)，需要進(jìn)行合理稀釋后再檢測。而實(shí)際操作中，稀釋需在無菌實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，考慮到紙片快速法本身就是在無菌室中進(jìn)行，且成本較低，所以高濃度細(xì)菌水樣適合采用紙片快速法檢測。

綜上，酶底物法的優(yōu)點(diǎn)是在實(shí)際操作中對環(huán)境要求不高，野外也能操作，步驟簡單，準(zhǔn)確度較高，檢出限較低，對于低、中濃度細(xì)菌水樣均適用;缺點(diǎn)是對高濃度水樣稀釋操作相對繁瑣，價格高。紙片快速法的優(yōu)點(diǎn)是價格低，對高濃度細(xì)菌水樣稀釋操作相對便捷。

3 結(jié)論

通過比較實(shí)驗(yàn)室常用的兩種總大腸菌群檢測方法——酶底物法和紙片快速法，確定酶底物法檢出限低，標(biāo)準(zhǔn)樣品準(zhǔn)確度高，操作簡便，可滿足實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測任務(wù);對不同濃度細(xì)菌水樣采用兩種方法分析發(fā)現(xiàn)，酶底物法適用于低、中濃度細(xì)菌水樣，紙片快速法適用于高濃度細(xì)菌水樣。實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度要求和不同水質(zhì)污染程度選取合適方法，具有一定的實(shí)驗(yàn)室推廣價值。

參考文獻(xiàn)

[1] 于志晶.組合式濾池處理受污染地表徑流水效果研究[D].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2019.

[2] 欒盛媛，張偉薇，張麗麗，等.糞大腸菌群檢測分析酶底物法[J].資源節(jié)約與環(huán)保，2019（4）：56.

[3] 劉儒平，王程，徐萬幫，等.基于生物素—親和素放大的SPR傳感器檢測大腸桿菌研究[J].傳感技術(shù)學(xué)報，2013，26（6）：757-761.

[4] 李康.基于納米材料的電化學(xué)DNA生物傳感器在快速檢測大腸桿菌中的應(yīng)用和研究[D].上海：華東師范大學(xué)，2011.

[5] 黃晶晶.納米材料在快速檢測水體中大腸桿菌的應(yīng)用和研究[D].上海：華東師范大學(xué)，2010.

[6] 程欲曉，金利通.電化學(xué)/生物傳感器快速檢測大腸桿菌的研究進(jìn)展[J].化學(xué)傳感器，2009，29（1）：3-8.

Comparison of Two Methods for Detection of Total Coliform

Bacteria in Water Quality Analysis

HUANG Jiao

（Liaoning Geology and Mineral Research Institute Co.， Ltd.， Shenyang 110032， China）

Abstract： In order to compare the detection effect of enzyme substrate method and rapid paper strip method on total coliform bacteria in water quality analysis， the accuracy of two certified reference samples （3 100 MPN/L and 3 700 MPN/L） was tested; Low （400 MPN/L）， medium （1.0×104 MPN/L） and high concentration （3.0×106 MPN/L） bacterial water samples were used to compare the applicability of two different methods. The results showed that the enzyme substrate method was more accurate; the enzyme substrate method was suitable for low and medium concentration bacterial water samples， and the rapid paper strip method was suitable for high concentration bacterial water samples. Therefore the laboratory can select the appropriate method according to the requirements of experimental accuracy and the different water quality pollution degree to meet the test production requirements.

Key words： water quality; Total Coliform Bacteria; detection method; enzyme substrate method; rapid paper strip method