廖華媛 張古月 龍 劍 李潤成

湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，長沙 410128

雞大腸桿菌病是由大腸埃希菌某些致病性菌株引起的，可產生不同的臨床表現(xiàn)，如死胚、敗血癥、腦膜炎、全眼球炎、腹膜炎等[1]。近年來，隨著養(yǎng)雞業(yè)的迅速發(fā)展，該病已成為困擾養(yǎng)雞場的重要疾病之一。由于該菌在環(huán)境中廣泛存在，且血清型較多，雞只是否出現(xiàn)發(fā)病通常與雞群的健康水平存在很大關系，飼養(yǎng)環(huán)境差、應激或其他病原的感染可導致雞群發(fā)生大腸桿菌病。此外，由于抗菌藥物的盲目使用，致使大腸桿菌耐藥菌株越來越多[2-4]，造成該病的臨床治療難度增加，常給養(yǎng)雞場帶來巨大損失。

2019年12月，衡陽某養(yǎng)雞場有3 棟雞舍，共約7 000 羽70～80日齡的肉雞。陸續(xù)有雞只發(fā)病，每天死亡30～40 羽不等。本文收集典型發(fā)病雞進行臨床解剖觀察、實驗室診斷，并結合診斷結果采取了綜合性防控措施，取得了明顯效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基為oxid 生產，麥康凱營養(yǎng)瓊脂、藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司，無菌脫纖綿羊血購自鄭州益康生物工程有限公司，PCR MIX 購于北京天恩澤生物技術有限公司，6 種不同廠家生產的獸藥（阿莫西林克拉維酸鉀粉末、硫酸慶大霉素可溶性粉、阿米卡星粉末、2 個不同廠家的頭孢噻呋鈉粉、新霉素可溶性粉）來自發(fā)病雞場。

1.2 病雞的臨床解剖

從發(fā)病雞場選取具有代表性臨床癥狀的病雞3只，采用常規(guī)方法進行解剖，同時根據(jù)臨床解剖情況采集主要病變臟器進行下一步實驗室檢測。

1.3 細菌的分離鑒定

采用無菌操作，從3 只雞病變臟器取組織劃線接種用BHI 加綿羊血制備的巧克力色營養(yǎng)瓊脂，37 ℃培養(yǎng)12 h 后觀察細菌生長情況，并根據(jù)菌落形態(tài)取數(shù)量上具有優(yōu)勢的代表性菌落進行革蘭氏染色鏡檢和培養(yǎng)特性分析。最后，根據(jù)培養(yǎng)特性和鏡檢情況確定疑似菌種，采用特異性引物進行PCR鑒定，引物參照文獻 [5]，上游引物為F 5'－ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGG－3'，下游引物為R 5'－GGTTTATGCAGCAACGAGACGTC－3'。

1.4 分離菌的藥物敏感性檢測

取分離的優(yōu)勢菌株混合，用紙片法進行藥物敏感性檢測，并參照藥敏紙片說明書進行結果的判定。

1.5 商品化獸藥對分離菌的抑制試驗

1）用BHI 培養(yǎng)基將雞場現(xiàn)有獸藥阿莫西林克拉維酸鉀粉、硫酸慶大霉素粉、硫酸新霉素粉、來自2 個不同廠家的頭孢噻呋鈉粉、硫酸阿米卡星粉（各產品說明標注使用濃度為0.1～0.5 g 粉末/L 水或kg飼料）均按0.1 g/mL 稀釋。

2）于96 孔細胞培養(yǎng)板第1～6 行的第1 孔分別加稀釋好的不同藥液200 μL/孔，然后每一行的第

2～12 孔分別加BHI 培養(yǎng)基100 μL/孔。

3）分別從各行的第1 孔取100 μL 至第2 孔混勻，再取100 μL 加入第3 孔依次加至第12 列后棄掉100 μL，將藥液梯度稀釋。

4）將分離菌培養(yǎng)液調至0.5 麥氏單位濃度，然后每孔加入30 μL，各行的第12 孔不加菌液，作為是否存在操作污染對照孔。

5）將培養(yǎng)板蓋好放入37 ℃溫箱孵育，0、6、24 h 各測定1 次OD600值。

1.6 防控方案的制定

根據(jù)臨床情況結合實驗室診斷結果，采取針對性措施，然后進行防控效果的評估。

2 結果與分析

2.1 臨床解剖觀察

臨床觀察發(fā)病雞表現(xiàn)呆立、精神沉郁（圖1），解剖3 只死亡病雞，2 只可見干酪樣物質包心、包肝（圖2），肺臟有出血和干酪樣物質黏附（圖3），1 只病雞肝臟有白色壞死點（圖4），3 只病雞腹腔均有干酪樣物質存在。

2.2 細菌分離培養(yǎng)鑒定

無菌操作取3 只病死雞肝臟組織劃線接種巧克力營養(yǎng)瓊脂，37 ℃培養(yǎng)12 h。結果發(fā)現(xiàn)3 個巧克力營養(yǎng)瓊脂均長滿灰白色、菌落形態(tài)一致的細菌，代表性結果見圖5。從3 個巧克力營養(yǎng)瓊脂中分別隨機挑選6 個單菌落，共18 個菌落劃線接種麥康凱營養(yǎng)瓊脂，結果18 個菌落來源的細菌均長成粉紅色菌苔。取菌苔液體增菌培養(yǎng)后革蘭氏染色鏡檢可見紅色桿狀細菌（圖6）。采用大腸桿菌鑒定引物進行PCR 擴增，結果均擴增出了預期大小的特異性條帶（圖7）。

2.3 分離菌藥物敏感性檢測

取分離菌的不同菌落混合后調整菌液濃度至0.5 麥氏單位濃度，然后采用紙片法進行藥物敏感性檢測，結果見表1。由表1可知，分離菌對新霉素、多粘菌素B、慶大霉素、阿米卡星、頭孢曲松、頭孢噻肟、呋喃唑酮比較敏感，但對恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林等耐藥。

2.4 雞場獸藥抑菌效果評價試驗

用雞場提供的獸藥，稀釋至最高濃度100 g/L、最低濃度為0.001 μg/L，然后進行分離菌的培養(yǎng)，結果見表2。由表2可知，培養(yǎng)板各行的對照孔（第12 孔）均沒有細菌生長，說明不存在操作污染的影響；A、B、C、E、F 號藥物所有稀釋度均能有效抑制分離菌的生長，在培養(yǎng)24 h 后，各培養(yǎng)孔均沒有出現(xiàn)OD600值的變化；D 號藥物慶大霉素，所有孔均出現(xiàn)OD600數(shù)值的增加，說明該藥物對分離菌沒有抑制作用（為確定各藥物檢測結果，進行了再一次重復試驗，結果仍然相同）。

圖1 病雞呆立精神沉郁

圖2 心臟、肝臟布滿黃色干酪樣物質

圖3 肺臟出血、附有干酪樣物質

圖4 肝臟有白色壞死點

圖5 肝臟組織細菌分離結果

圖6 分離菌革蘭氏染色鏡檢結果

圖7 分離菌PCR 鑒定結果

2.5 防控措施

根據(jù)藥物敏感性檢測結果，給雞群采用飼料中添加阿莫西林克拉維酸鉀、飲水中添加新霉素，連用4 d，結果該雞場3 棟雞舍中的1 棟雞舍很快控制了疫情，但另外2 棟未能達到理想的防控效果。調查原因可能為另外2 棟雞舍裝有水簾、水簾上縫隙未進行密封，雞舍溫度較低，且該2 棟雞舍在轉群時谷殼墊料較薄。后來將水簾進行密封，并更換墊料，同時增加墊料的厚度，再采用硫酸粘桿菌素拌料、頭孢噻呋鈉可溶性粉末飲水飼喂3～4 d，雞群逐漸康復。

表1 分離菌藥物敏感性檢測結果

表2 培養(yǎng)24 h 后各藥物對分離菌的抑制情況

3 討 論

本文對某雞場出現(xiàn)雞群精神沉郁、拉稀，死亡的病例進行了臨床分析以及細菌分離鑒定，結果證實雞群存在大腸桿菌感染。通過采用商品化藥敏紙片進行分離菌的藥物敏感性檢測，發(fā)現(xiàn)分離菌存在較強的耐藥性，僅對慶大霉素、多粘菌素B、阿米卡星、新霉素、頭孢曲松等比較敏感。此外，本文采用雞場購買的獸藥進行分離菌藥物敏感性分析發(fā)現(xiàn)，阿莫西林克拉維酸鉀、頭孢噻呋鈉、阿米卡星、新霉素均比較有效，但慶大霉素完全沒有效果，這與商品化藥敏紙片得到的結果存在差異。至于為什么不同來源相同成分藥物對同一株細菌抑制效果有差異，不排除存在某些藥物成分含量不夠或實際成分與標識有差異的可能。因此，雞場在進行細菌藥敏檢測時，選用購買的獸藥進行敏感性檢測對于保證用藥效果有時具有非常重要的作用。

本文根據(jù)藥敏檢測結果，選用敏感藥物進行防控，結果條件較好的雞舍取得了預期效果，而環(huán)境條件差的雞舍未能取得理想效果，直到將水簾密封、提高雞舍溫度、更換墊料并增加其厚度、降低環(huán)境中病原含量、提高墊料保暖效果，才控制好發(fā)病情況?？梢?，雞群大腸桿菌感染除采用敏感藥物進行防治外，環(huán)境改善同樣是不可缺少的重要措施。