吳麗群 張延明 趙麗杰

關(guān)鍵詞：TBP;β微管蛋白基因;分子標(biāo)記;遺傳多樣性;種質(zhì)資源親緣關(guān)系

DNA分子標(biāo)記技術(shù)因多態(tài)性高、檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、表達(dá)產(chǎn)物不依賴于植物的發(fā)育階段和環(huán)境因素等優(yōu)點(diǎn)，在作物遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、重要性狀基因定位與克隆、種質(zhì)資源遺傳多樣性與系統(tǒng)發(fā)育分析、品種指紋圖譜繪制及遺傳純度檢測(cè)等方面應(yīng)用廣泛[1-2]。遺傳多樣性是種內(nèi)不同種群之間或一個(gè)種群內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異程度。遺傳多樣性的評(píng)估對(duì)于研究生物多樣性、種群動(dòng)態(tài)和生態(tài)關(guān)系非常重要，可以為研究物種起源、品種分類、親本選配、品種保護(hù)等提供依據(jù)，是支持新品種開發(fā)和研究，保護(hù)和利用現(xiàn)有種質(zhì)資源的重要基礎(chǔ)[3-5]。

隨著基因組學(xué)的發(fā)展，基于特定基因家族或基因潛在可變區(qū)域來(lái)評(píng)估遺傳變異的技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用，此方面的研究已在多種植物中報(bào)道過(guò)，其中內(nèi)含子長(zhǎng)度多態(tài)性（intron length polymorphism，簡(jiǎn)稱ILP）是研究特定基因家族內(nèi)含子的有效工具[6-7]。內(nèi)含子為非編碼序列，更容易積累變異，且內(nèi)含子的位置在物種間存在高度保守性[8]。微管蛋白基因家族對(duì)維持細(xì)胞的形態(tài)和功能及植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用，而且廣泛參與調(diào)節(jié)植物的生物和非生物脅迫[9-11]。有研究發(fā)現(xiàn)，植株的矮化與植物體中微管的減少、變短和分離相關(guān)[12]。侯董亮等研究表明，轉(zhuǎn)錄本號(hào)為PCP044487.1的β微管蛋白基因可能與梨矮生性狀形成的分子調(diào)控有關(guān)[13]。張海月等的研究結(jié)果表明，來(lái)自蘋果的β微管蛋白基因家族成員之一（轉(zhuǎn)錄本號(hào)為MDP0000749824.1）的表達(dá)水平，可能受激素調(diào)控的作用進(jìn)而對(duì)莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)造成影響等[14]。因此，對(duì)β微管蛋白基因家族進(jìn)行研究具有重要意義。

基于微管蛋白多態(tài)性（tubulin-based polymorphism，簡(jiǎn)稱TBP）分子標(biāo)記技術(shù)是通對(duì)植物β微管蛋白家族基因DNA內(nèi)含子的長(zhǎng)度來(lái)評(píng)估遺傳變異，對(duì)于植物物種遺傳多樣性分析和植物分類學(xué)來(lái)說(shuō)是非常有效的[15-18]。通過(guò)設(shè)計(jì)在兩側(cè)外顯子上的引物來(lái)檢測(cè)內(nèi)含子的長(zhǎng)度，比引物設(shè)計(jì)在非編碼區(qū)域的分子標(biāo)記，更能直接反映基因內(nèi)的變異，且不受表型影響，操作簡(jiǎn)單方便、試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，對(duì)廣泛生物的遺傳識(shí)別非常有用，具有更廣闊的應(yīng)用前景[19-21]。經(jīng)過(guò)近幾年的迅速發(fā)展，TBP分子標(biāo)記已應(yīng)用于多種植物的多個(gè)研究領(lǐng)域，在植物種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析等方面均取得了階段性的進(jìn)展，但未見相關(guān)中文報(bào)道。本研究對(duì)TBP標(biāo)記技術(shù)原理及在植物遺傳多樣性研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為該標(biāo)記的研究和應(yīng)用提供參考。

1 TBP分子標(biāo)記技術(shù)

1.1 TBP分子標(biāo)記技術(shù)原理

β微管蛋白是微管的主要組成成分之一，與α微管蛋白共同參與細(xì)胞形態(tài)的維持、胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞分裂、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等活動(dòng)[22-25]。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物、植物、原生生物和真菌中的β微管蛋白氨基酸序列相似性高達(dá)88%以上[26-28]。目前為止，很多植物的β微管蛋白基因已被克隆或鑒定，例如在擬南芥中有9個(gè)β微管蛋白基因[29]、水稻中有8個(gè)[30]、玉米（Zea mays L.）中有6個(gè)[31]、毛果楊（Populus trichocarpa Torr. & Gray）中有20個(gè)[32]、美洲山楊（Populus tremuloides Michx.）中有20個(gè)[32]、旱柳（Salix matsudana Koidz.）和龍爪柳[S.matsudana var. tortusoa （Vilm.） Rehd.]中均有20個(gè)[26，33]，此外，亞麻（Linum usitatissimum L.）[34]、梨（Pyrus spp.）[28]、蘋果（Malus Mill.）[14]中已有關(guān)于β微管蛋白基因的報(bào)道。植物β微管蛋白基因的組成通常是保守的，有2個(gè)內(nèi)含子位于編碼區(qū)中的固定位置，且2個(gè)內(nèi)含子大小不一致[35]。所有植物β微管蛋白基因組第1個(gè)內(nèi)含子位于ATG密碼子的396個(gè)核苷酸位置，第2個(gè)位于742個(gè)核苷酸位置，其中玉米β微管蛋白基因（TUB1）和水稻β微管蛋白基因（TUB2）是例外，它們只有第1個(gè)內(nèi)含子[18]，不同的β微管蛋白基因的內(nèi)含子的長(zhǎng)度是不同的。TBP分子標(biāo)記的原理如圖1所示。

1.2 TBP分子標(biāo)記的特點(diǎn)

傳統(tǒng)的隨機(jī)DNA分子標(biāo)記已被證明是有效且可靠的，但這些標(biāo)記也存在一定的缺點(diǎn)和不足。例如，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，簡(jiǎn)稱AFLP）標(biāo)記試驗(yàn)成本高、技術(shù)繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)樣本DNA的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求較為嚴(yán)格[36];隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，簡(jiǎn)稱RAPD）技術(shù)穩(wěn)定性和重復(fù)性不好，試驗(yàn)結(jié)果不夠可靠[37];簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（simple sequence repeats，簡(jiǎn)稱SSR）技術(shù)引物開發(fā)成本高，且只能對(duì)重復(fù)序列區(qū)域進(jìn)行染色體定位等[38]。

與目前大多數(shù)分子標(biāo)記的方法相比，TBP分子標(biāo)記技術(shù)有如下特點(diǎn)[18，39]：（1）不需要有關(guān)植物基因組的序列信息;（2）基于β微管蛋白基因DNA序列，提供了一個(gè)幾乎是單個(gè)位點(diǎn)的靶點(diǎn)，而其他植物基因家族的成員往往在基因組中排列緊密;（3）不受進(jìn)化環(huán)境等條件約束;（4）引物具有通用性。基于內(nèi)含子非編碼區(qū)，設(shè)計(jì)引物簡(jiǎn)單，可以使用1對(duì)通用引物來(lái)完成;（5）建立在以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱PCR）基礎(chǔ)之上，擴(kuò)增產(chǎn)物可用聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)檢測(cè)，試驗(yàn)過(guò)程操作簡(jiǎn)單;（6）對(duì)DNA的質(zhì)量要求低、用量少、靈敏度高;（7）多態(tài)性豐富;（8）數(shù)據(jù)分析簡(jiǎn)便。

1.3 TBP分子標(biāo)記的引物設(shè)計(jì)

植物β微管蛋白基因的第1個(gè)內(nèi)含子的位置是非常保守的，位于所有植物物種ATG密碼子的396個(gè)核苷酸位置。根據(jù)第1個(gè)內(nèi)含子序列的位置來(lái)設(shè)計(jì)TBP-F和TBP-R引物擴(kuò)增目的基因片段。目前已篩選并應(yīng)用于試驗(yàn)研究的引物總結(jié)如表1所示。

1.4 PCR反應(yīng)體系

TBP是PCR為基礎(chǔ)，其中PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件是影響試驗(yàn)結(jié)果的重要因素[42]。Bardini等通過(guò)試驗(yàn)，建立了以20 μL反應(yīng)體系為基礎(chǔ)的PCR檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)最適條件：94 ℃預(yù)變性 3 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán);最后在72 ℃延伸8 min，并保持在15 ℃，該反應(yīng)體系和條件已成功應(yīng)用于油菜（Brassica napus L.）、咖啡（Coffea Linn.）、亞麻等植物品種[18，39]。Gavazzi等對(duì)葡萄屬（Vitis）的植物進(jìn)行TBP分析，得出最佳PCR條件為：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 45 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán);最終在72 ℃延伸30 min[40]。

1.5 PCR 產(chǎn)物檢測(cè)

分子標(biāo)記的檢測(cè)主要利用聚丙烯酰胺凝膠電泳和瓊脂糖凝膠電泳2種技術(shù)[43]。Bardini等的研究結(jié)果表明，6%變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)TBP分子標(biāo)記效果最好[18，39]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，Gavazzi等研究出基于毛細(xì)管電泳和熒光檢測(cè)TBP的技術(shù)，與傳統(tǒng)方法相比，該方法具有試驗(yàn)操作可自動(dòng)化、速度快、分辨率高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)[41]。

2 TBP分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用

2.1 遺傳多樣性分析

微衛(wèi)星簡(jiǎn)單序列重復(fù)（sinple sequence repeat，簡(jiǎn)稱SSR）因多態(tài)性高、數(shù)量豐富、重復(fù)性好、呈共顯性，且廣泛分布于基因組等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性的研究中[44]。

Bardini等利用TBP分子標(biāo)記方法研究了6個(gè)品種油菜的遺傳多樣性，并與SSR方法進(jìn)行比較分析[18]。凝膠電泳結(jié)果表明，2種方法均顯示了品種間和品種內(nèi)的多態(tài)性。通過(guò)對(duì)6個(gè)品種進(jìn)行266個(gè)指紋分析，主成分分析結(jié)果表明，TBP方法提供了關(guān)于遺傳相似性的信息，類似于使用SSR標(biāo)記獲得的結(jié)果。利用分子方差分析法（analysis of molecular variance，簡(jiǎn)稱AMOVA）分析數(shù)據(jù)，驗(yàn)證2種方法在油菜品種間和品種內(nèi)的區(qū)別程度。TBP方法能夠檢測(cè)出品種間的方差為66%，品種內(nèi)的方差為34%，這些值與SSR分子標(biāo)記中80%和20%的值相差不大。此外，利用遺傳估算值比較分析2種方法在品種鑒定能力的相似性，得到的相關(guān)值為0.65（P>0001）。Rabokon等利用TBP和SSR分子標(biāo)記比較分析亞麻屬植物的遺傳變異與16個(gè)亞麻品種TBP的結(jié)果表明，樣品中均檢測(cè)到大量單一性條帶，多態(tài)信息含量（polymorphism information content，簡(jiǎn)稱PIC）為0.48，Nei和Li的相似系數(shù)在大多數(shù)基因型中都在0.25～1.00范圍內(nèi)。SSR分析結(jié)果表明，在16個(gè)樣本中Nei和Li的相似系數(shù)值均在0.0～1.0之間，PIC分別在0.81～0.61之間[39]。以上研究結(jié)果證明，TBP可以成功地應(yīng)用于亞麻品種和基因型的鑒別，并且操作時(shí)間相對(duì)較少，不須要處理大量的數(shù)據(jù)。根據(jù)計(jì)算出的PIC，TBP數(shù)據(jù)同SSR分析中得到的數(shù)據(jù)一樣可靠，TBP方法對(duì)亞麻基因型的分辨具有較高的效率。Gavazzi等對(duì)來(lái)自葡萄屬37個(gè)材料進(jìn)行TBP分子標(biāo)記分析，并與6組SSR標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明TBP方法在葡萄屬基因分型領(lǐng)域具有可行性和可靠性[40]。

以上研究結(jié)果均表明，TBP分子標(biāo)記與SSR分子標(biāo)記的分析結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證明TBP分子標(biāo)記的可靠性，且TBP分子標(biāo)記更能揭示供試材料的親緣關(guān)系，具有高效性，可以單獨(dú)使用，也可以和其他標(biāo)記方法同時(shí)使用，有利于減小單一標(biāo)記方法使用時(shí)的誤差。

2.2 種質(zhì)資源親緣關(guān)系分析

近年來(lái)，由于各地域相互引種，種質(zhì)交流日益頻繁，不斷出現(xiàn)同物異名或同名異物的現(xiàn)象，這使得對(duì)種質(zhì)的鑒定提出了更高的要求。同時(shí)，通過(guò)傳統(tǒng)鑒定方法進(jìn)行品種的鑒別和雜種鑒定，其周期較長(zhǎng)，而且表型性狀等形態(tài)學(xué)特征容易受到環(huán)境條件的影響[45-46]，因此TBP分子標(biāo)記的應(yīng)用為植物種質(zhì)鑒定研究提供了一種新方法，為豐富種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究提供一條新途徑。

Bardini 等利用TBP分子標(biāo)記對(duì)來(lái)自于不同國(guó)家的二倍體咖啡C. eugenoides 、C. canephora以及四倍體咖啡C. arabica進(jìn)行分析，在四倍體咖啡C. arabica樣本中均擴(kuò)增出4個(gè)TBP條帶，在C.canephora樣本中擴(kuò)增出其中3條，沒(méi)擴(kuò)增出的那條在C. eugenoides樣本中擴(kuò)增出來(lái)，支持C. eugenoides是C. arabica的祖源的假設(shè)[18]，這與Anthony等通過(guò)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length play morphism，簡(jiǎn)稱AFLP）和SSR標(biāo)記所獲得的研究結(jié)果[47]一致。此外，有研究者對(duì)5種百脈根（Lotus alpinus、 L. corniculatus、 L. angustissimus、L. tenuis、L. pedunculatus）進(jìn)行TBP分析，其中四倍體L. corniculatus樣本具有較好的多態(tài)性。在L. corniculatus樣本中發(fā)現(xiàn)，與四倍體L. alpinus以及二倍體L. tenuis和L. angustissimus樣本中相似的條帶，而在二倍體和四倍體的 L. pedunculatus 樣本中未發(fā)現(xiàn)，證明L. pedunculatus 不是L. corniculatus的祖先，這與Campos等的研究結(jié)果[48]一致。L. alpinus和L. tenuis的祖先可能是L. corniculatus，這與Roos等的研究結(jié)果[49]一致。此外，二倍體和四倍體的L. pedunculatus TBP條帶沒(méi)有差異，證明該四倍體是同源多倍體。相比較于表現(xiàn)出單一獨(dú)特模式的二倍體L. alpinus TBP結(jié)果，四倍體L. alpinus則具有更顯著的變化特征，表明四倍體L. alpinus并非源自二倍體L. alpinus的同源四倍體，更有可能來(lái)自2個(gè)二倍體物種之間的雜交。

此外，TBP分子標(biāo)記在大麥、水稻和小麥研究中也有應(yīng)用，但多態(tài)性低。目前，通過(guò)引物序列的修改已在菊花屬和木筒篙屬中成功地?cái)U(kuò)增出TBP條帶[18]。

3 問(wèn)題與展望

TBP作為一種新型的分子標(biāo)記，已成功地應(yīng)用于大范圍的單子葉和雙子葉物種，并同SSR標(biāo)記獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，充分證明了TBP的可靠性。此外，TBP不需要植物基因組更多的信息，試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)，該方法適合于評(píng)估遺傳多樣性和基因組起源。然而，與目前其他DNA分子標(biāo)記的方法相比，TBP分子標(biāo)記具有一定的局限性：（1） TBP方法只能檢測(cè)1組有限的標(biāo)記，與SSR或其他方法相比，需要大量試驗(yàn)材料來(lái)獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的系統(tǒng)發(fā)育樹。（2） 對(duì)于高自交系栽培作物所獲得的遺傳多樣性水平低，原因可能是這些農(nóng)業(yè)作物的近親繁殖[18]。

筆者認(rèn)為，TBP分子標(biāo)記的利用應(yīng)加強(qiáng)以下幾個(gè)方面的研究：（1） 大量開發(fā)具有材料特異性的TBP引物。TBP分子標(biāo)記引物的通用性強(qiáng)，但文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)量依然有限，無(wú)法滿足研究的需要。（2） 建立并優(yōu)化適合TBP分子標(biāo)記類型的PCR反應(yīng)體系。因?yàn)樵跇?biāo)記分析同一材料時(shí)，PCR最優(yōu)反應(yīng)體系存在差異，而同一標(biāo)記類型應(yīng)用于不同的材料時(shí)，其體系也存在不同[50]。因此，建立優(yōu)化適合特定材料的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，是應(yīng)用TBP分子標(biāo)記的基礎(chǔ)。（3） 加強(qiáng)TBP分子標(biāo)記在種質(zhì)鑒定與指紋圖譜構(gòu)建的應(yīng)用。TBP作為一種新型分子標(biāo)記在油菜、咖啡、亞麻、葡萄等植物中表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，成功應(yīng)用于品種的鑒別和雜種鑒定，不僅可以實(shí)現(xiàn)品種保護(hù)，而且還可以提高種質(zhì)純度，給生產(chǎn)與研究帶來(lái)了便利。雖然TBP分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用尚在起步階段，但相信隨著基因組學(xué)和檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，其在遺傳多樣性精確評(píng)價(jià)、種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)與利用、種質(zhì)鑒定與輔助育種等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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