郭 升

(羅田縣人民醫(yī)院，湖北 羅田 438600)

在對心腦血管疾病進(jìn)行一級、二級預(yù)防比較常見且效果顯著的藥物就包含阿司匹林，曾有研究指出，患者規(guī)律性服用阿司匹林可有效降低心腦血管事件的發(fā)生[1]。但是盡管患者長期規(guī)律性服用阿司匹林，但仍有許多患者會發(fā)生心腦血管疾病，也就是說阿司匹林治療效果失敗[2]。服用阿司匹林的患者發(fā)生血栓大多數(shù)是因為血小板聚集不能被抑制，進(jìn)而發(fā)生心腦血管疾病，筆者稱其為阿司匹林抵抗(AR)[3]?；蜃儺悺⑺幬锵嗷プ饔靡约吧锢枚鹊偷榷喾N因素均會導(dǎo)致阿司匹林抵抗[4]。目前對于阿司匹林抵抗患者基因因素的研究已成為臨床研究熱點(diǎn)[5]。P-糖蛋白是有多藥物耐藥基因編碼，是一種ATP依賴性藥物轉(zhuǎn)運(yùn)膜蛋白，在多種藥物的藥代動力學(xué)中起著非常重要的作用[6]。該蛋白可在腸道上皮細(xì)胞表面進(jìn)行表達(dá)，有腸上皮細(xì)胞將其底物逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至腸腔，使藥物吸收受到限制，降低藥物的生物利用度[7]。而P-糖蛋白的其中一項作用底物即為阿司匹林。筆者對多藥物耐藥基因與阿司匹林抵抗之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，進(jìn)而進(jìn)一步了解阿司匹林抵抗的發(fā)生原因?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2016年5月～2017年5月我院收治缺血性腦卒中患者230例，根據(jù)其對阿司匹林的敏感程度，將阿司匹林敏感(AS)80例設(shè)為對照組，阿司匹林抵抗(AR)150例設(shè)為研究組。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)CT檢查，入組患者確診為缺血性腦卒中；②患者在發(fā)病后均口服阿司匹林進(jìn)行規(guī)律治療；③入組患者對于本次研究內(nèi)容知情，并且在同意書上簽字。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者同時服用其他抗血小板藥物、抗凝藥物或非甾體類藥物治療；②患者對本次研究所用藥物過敏；③患者伴有哮喘；④患者伴有嚴(yán)重肝腎功能障礙；⑤患者存在嚴(yán)重的精神障礙或溝通障礙。

1.2方法

1.2.1進(jìn)行樣本收集：取患者清晨空腹上肢靜脈血，置于EDTA管中，在-20℃的低溫冰箱中儲存?zhèn)溆?，提取基因組DNA，將其放置于-20℃的低溫冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試驗：本次研究采用直接測序法以及聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)分析，聚合酶鏈反應(yīng)體系為2 m模板DNA、2+TaqMasterMixl2.5td 、5 μl上下游引物、0.5 μl超純凈水補(bǔ)足體系至25 μl，將其充分混勻。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴(kuò)增條件，3 min預(yù)變性94℃，30 s變性94℃，30 s延伸72℃，5 min最后延伸72℃，用2%瓊脂糖凝膠對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，染色使用Gelred進(jìn)行，觀察結(jié)果在紫外燈下進(jìn)行。

1.2.3進(jìn)行酶切消化:取2 μl聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物，1 μl內(nèi)切酶，2 μl 10×NEB Burrer，5 μl滅菌離子雙蒸餾水，總反應(yīng)體積為10 μl，酶切反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，時間為30 min。電泳使用2%瓊脂糖凝膠以及140 V穩(wěn)定電壓進(jìn)行，時間為30 min，染色使用Gelred進(jìn)行，觀察結(jié)果在紫外燈下進(jìn)行。

1.2.4對基因進(jìn)行測序:由生工生物工程股份有限公司進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物以及樣本測序。

1.3觀察指標(biāo):觀察患者相關(guān)臨床指標(biāo)，包括年齡、性別、空腹血糖水平、總膽固醇水平、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、吸煙史、高血壓疾病以及飲酒史等。

2 結(jié)果

2.1兩組臨床資料比較:研究組吸煙患者概率、空腹血糖水平以及總膽固醇水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，研究組性別、年齡、高血壓病史、飲酒史、三酰甘油水平、高密度脂蛋白以及低密度脂蛋白水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 臨床資料對比

項目研究組(n=80)對照組(n=120)檢驗值P值性別[例(%)] 男46(57.5)80(66.7)1.314>0.05 女34(42.5)40(33.3)年齡(x±s,歲)63.1±11.563.1±11.41.344>0.05空腹血糖(x±s,mmol/L)6.5±1.55.7±1.114.397<0.05總膽固醇(x±s,mmol/L)5.4±1.24.4±1.114.971<0.05三酰甘油(x±s,mmol/L)1.5±0.41.6±0.61.314>0.05低密度脂蛋白(x±s,mmol/L)2.5±0.62.3±0.40.464>0.05高密度脂蛋白(x±s,mmol/L)1.2±0.31.3±0.21.034>0.05吸煙史[例(%)] 是27(33.8)24(20.0)14.613<0.05 否53(66.3)96(80.0)高血壓病史[例(%)] 是38(47.5)69(57.5)1.464>0.05 否42(52.5)51(42.5)飲酒史[例(%)] 是8(10.0)6(5.0)0.311>0.05 否72(90.0)114(95.0)

2.2基因頻率及基因型分析：本次研究納入患者，研究組等位基因檢測數(shù)量為158，對照組組等位基因檢測數(shù)量為446，其中研究組C3435T位點(diǎn)的T等位基因頻率及CT+rI-11基因型高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3阿司匹林抵抗危險因素Logistic回歸分析：阿司匹林抵抗獨(dú)立危險因素包含吸煙史、基因型、空腹血糖、總膽固醇，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表2 基因頻率及基因型對比[例(%)]

項目研究組(n=80)對照組(n=120)χ2值P值等位基因C1236TC136(86.1)396(88.8)0.464>0.05T22(13.9)50(11.2)G2677T/AA22(13.9)67(15.0)0.391>0.05G58(36.7)187(41.9)T78(49.4)192(43.0)C3435TC66(41.8)254(57.0)4.641<0.05T92(58.2)192(43.0)基因型C1236TCC58(72.5)94(78.3)0.487>0.05CT22(27.5)26(21.7)G2677T/AAA1(1.3)2(1.7)0.367>0.05AT13(16.3)19(13.3)AG8(10.0)12(10.0)GG10(12.5)21(17.5)GT32(40.0)47(39.2)TT16(20.0)19(15.8)C3435TCC17(21.3)41(34.2)4.391<0.05CT34(42.5)54(45.0)TT29(36.3)25(20.8)

表3 阿司匹林抵抗危險因素Logistic回歸分析

因素β值標(biāo)準(zhǔn)誤χ2值P值OR值95%CI吸煙史0.7520.3044.347<0.052.1341.131～3.897基因型1.5120.5475.317<0.054.2341.314～12.141空腹血糖0.1360.0935.347<0.051.6740.947～1.453總膽固醇0.7210.2816.177<0.052.1371.171～3.547

3 討論

近年來，關(guān)于多藥物耐藥基因編碼產(chǎn)物P-糖蛋白對于疾病以及藥物的影響研究已成為熱點(diǎn)，P-糖蛋白作為外排泵，可以對有機(jī)陽離子、多糖、蛋白質(zhì)以及氨基酸產(chǎn)生對抗作用，進(jìn)而起到保護(hù)的目的[8]。但是，該蛋白可以將藥物利用ATP水解釋放的能量泵出細(xì)胞，降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體表現(xiàn)出耐藥性。曾有學(xué)者在研究中指出，細(xì)胞內(nèi)阿司匹林的濃度會通過P-糖蛋白膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，當(dāng)P-糖蛋白表達(dá)水平明顯增加時，阿司匹林在細(xì)胞內(nèi)的濃度會降低，進(jìn)而使阿司匹林對小腸的損傷程度降低[9]。因此可以看出，多藥耐藥基因多態(tài)性可能會對P-糖蛋白的表達(dá)以及活性產(chǎn)生影響，進(jìn)而使機(jī)體對于阿司匹林的分布、吸收受到影響，使有效血藥濃度降低，進(jìn)而形成阿司匹林抵抗情況[10]。

筆者此次研究通過對缺血性腦卒中患者進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)，研究組吸煙患者概率、空腹血糖水平以及總膽固醇水平高于，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，研究組性別、年齡、高血壓病史、飲酒史、三酰甘油水平、高密度脂蛋白以及低密度脂蛋白水平與對照組無明顯差異(P>0.05)，且研究組C3435T位點(diǎn)的T等位基因頻率及CT+rI-11基因型高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。筆者此次研究中發(fā)現(xiàn)基因型C3435T與阿司匹林抵抗有關(guān)，因此，筆者認(rèn)為T地位基因有可能是導(dǎo)致患者出現(xiàn)阿司匹林抵抗的一個危險因素。而且在研究中得出，吸煙、空腹血糖以及總膽固醇也會增加患者發(fā)生阿司匹林抵抗的發(fā)生，因此建議對阿司匹林抵抗患者進(jìn)行綜合分析。

綜上所述，C3435T基因多態(tài)性與阿司匹林抵抗有關(guān)，吸煙史、基因型、空腹血糖以及總膽固醇含量是阿司匹林抵抗的獨(dú)立危險因素。