呂 穎

(北京市北運(yùn)河管理處，北京 101101)

水環(huán)境有機(jī)污染物主要來源于人類活動，具體包括生活污水、畜禽養(yǎng)殖廢水及各類工業(yè)廢水[1]。污染水環(huán)境的主要物質(zhì)有石油類、農(nóng)藥、表面活性劑以及酚類等化學(xué)物質(zhì)，還有一些腐殖質(zhì)、多糖類等非揮發(fā)性的有機(jī)物質(zhì)，這些污染物在轉(zhuǎn)化降解時會消耗水中的溶解氧，惡化水質(zhì)，破壞生態(tài)平衡[2]。微生物轉(zhuǎn)化過程是通過微生物細(xì)胞修復(fù)復(fù)雜的底物結(jié)構(gòu)，即使用微生物代謝過程中產(chǎn)生的酶，催化底物反應(yīng)[3]。代謝調(diào)控可以打破微生物細(xì)胞內(nèi)的自動調(diào)節(jié)機(jī)制，使其朝著人們所期望的方向發(fā)展。研究水環(huán)境有機(jī)污染物微生物轉(zhuǎn)化的代謝調(diào)控，可以更好地監(jiān)測水環(huán)境中的污染物的變化，改善水質(zhì)[4]。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)有機(jī)物及微生物

實(shí)驗(yàn)采用居民居住區(qū)周圍的河流水源，在水源周圍設(shè)立3個不同的水樣采集點(diǎn)(A、B、C點(diǎn))，采集點(diǎn)A、B、C具體位置見圖1。

圖1 水樣采集點(diǎn)位置

有關(guān)研究表明:真菌分裂、生長、孢子萌發(fā)都與碳濃度大小有關(guān)，在真菌中起著調(diào)節(jié)傳輸物質(zhì)的作用，還會調(diào)節(jié)氨基酸的傳輸，不同的微生物體內(nèi)都有特異代謝方式[5]。實(shí)驗(yàn)使用長孢葡萄穗酶，將菌株接種于種子培養(yǎng)液中，培養(yǎng)3天后獲得微生物子液，再將甘油與生理鹽水調(diào)和為4∶6的比例混合均勻，將此時的混合液與微生物子液按照1∶1的比例混合于凍藏管，放在-80℃冷凍室中保存。新鮮的微生物子液放置在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，獲得孢子，然后將獲得的孢子置于冷凍真空干燥的環(huán)境中保存[6]。

1.2 培養(yǎng)基

使用直徑90mm、高15mm、容量13mL×3格的一次性微生物培養(yǎng)皿，為方便對比，培養(yǎng)基配置3種培養(yǎng)基溶液：斜面培養(yǎng)基(PSA培養(yǎng)基)、種子培養(yǎng)基(GSB培養(yǎng)基)以及原始發(fā)酵培養(yǎng)基(改良查氏培養(yǎng)基)。

斜面培養(yǎng)基：將土豆去皮，切成薄片取30g，加入70g蒸餾水，煮至土豆松軟，使用四層紗布將土豆變?yōu)槟酄?，制成濃度?5g/L的土豆溶液。加入蔗糖15g/L，瓊脂20g/L，然后將整個培養(yǎng)基的水分補(bǔ)水至100mL，然后放入微波爐中加熱直至瓊脂全部溶解的狀態(tài)，斜面培養(yǎng)基中的溶液制作完畢，將溶液分裝到試管中[7]。

種子培養(yǎng)基的具體配置成分見表1。混合表1中的各成分，使用6號成分的鹽酸將培養(yǎng)基溶液的pH值調(diào)節(jié)至6。

表1 種子培養(yǎng)基配置成分濃度

原始發(fā)酵培養(yǎng)基的具體配置見表2?；旌媳?中的各成分，使用11號濃度的鹽酸將培養(yǎng)皿溶液的pH值調(diào)節(jié)至6。

制備好以上3種培養(yǎng)基，全部置于121℃條件下滅菌15min。

表2 原始發(fā)酵培養(yǎng)基配置各成分濃度

續(xù)表

1.3 原始培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)條件：將凍庫管中的菌液均勻涂布于斜面培養(yǎng)基中，放置霉菌培養(yǎng)箱中，保持培養(yǎng)箱的溫度為25℃，培養(yǎng)6天。

種子培養(yǎng)條件：使用接種環(huán)在菌種斜面上刮取拇指大小的菌體，接種到種子培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，將錐形瓶放置在25℃、180r/min搖床中培養(yǎng)6天。

發(fā)酵培養(yǎng)條件：取2mL種子培養(yǎng)基中的液體，接種到200mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，將其置于25℃、180r/min搖床中培養(yǎng)6天[8]。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)試劑包括瓊脂、蔗糖、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、無水硫化鈣、氯化鈣、氯化鈉、氯化鈷、鹽酸、葡萄糖、氯化鉀、硫酸亞鐵、可溶性淀粉、脫脂大豆粉、細(xì)菌學(xué)蛋白胨、酵母提取物；實(shí)際代謝調(diào)控時的儀器使用霉菌培養(yǎng)箱[9]。

1.5 調(diào)控方法

調(diào)控前先將接種方式更改為直接接種孢子的方式，依據(jù)轉(zhuǎn)化時間，更換培養(yǎng)條件：將300萬個孢子接種于100mL種子培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，接種量為5%，培養(yǎng)26～28h。培養(yǎng)溫度均為25℃，轉(zhuǎn)速為180r/min。菌體在培養(yǎng)基內(nèi)要維持生長需要的足夠的碳，搖動發(fā)酵液后，此時微生物代謝會進(jìn)入TCA循環(huán)，產(chǎn)生大量的能量供給微生物的生命活動[10]。改變常見碳源的濃度梯度，或改變常見碳源的成分，將碳濃度設(shè)定為表3中數(shù)值。

使用表3中調(diào)控的碳源濃度，設(shè)定3種不同梯度碳源濃度，發(fā)酵期為6天，使用150mL的錐形瓶，裝取75mL混有3種不同濃度的碳源的培養(yǎng)液[11]。計(jì)算菌體濕重公式為

(1)

式中：W為菌體濕重；CS為培養(yǎng)基面積；FS為視野面積；Fn為每片計(jì)數(shù)過的視野數(shù)；V為1L水經(jīng)沉淀濃縮后的體積；v為計(jì)數(shù)框體積；Pn為每片通過計(jì)算實(shí)際數(shù)出的菌類個數(shù)[12]。

菌體干重的計(jì)算公式為

(2)

式中：M為菌體干重；x，y為培養(yǎng)基觀測位置；t為實(shí)驗(yàn)時間；C為(x,y)處t時刻碳濃度；n為pH值大?。籇x為橫向彌散系數(shù)；Dy為縱向彌散系數(shù)[13]。

1.5.1 低碳源

將發(fā)酵液搖晃均勻后，取10mL置于布氏漏斗中，同時加入100mL去離子水沖洗，真空抽濾，水分抽濾干后將濾紙置于65℃烘箱中11h,烘干，然后置于干燥器中恒重24h，稱重，計(jì)算菌體干重。

1.5.2 中碳源

取發(fā)酵液750μL于2mL的離心管中，加入750μL發(fā)酵液與甲醛1∶1萃取后的溶液，混合均勻后，使用超聲波超聲提取5min，使用1mL注射器吸取溶液上部分清液，然后使用尺寸為0.45μm的濾頭過濾，用高效液相色譜測定菌體的干濕重。

1.5.3 高碳源

高碳源調(diào)控方法使用HPLC檢測，設(shè)定檢測條件為Kromasil-C18液相色譜柱，柱溫40℃，檢測波長為260mm，流速為1mL/min，進(jìn)樣量為20μL，流動相為0.1%三氟乙酸和乙腈線性梯度洗脫。設(shè)置洗脫梯度為：0.01～30.00min，45%B相；30.00～35.00min，85%B相[14]。配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(10mg/L、25mg/L、55mg/L、95mg/L、125mg/L、225mg/L、325mg/L、425mg/L、525mg/L)，計(jì)算得到相峰積分，然后計(jì)算各個相峰面積，得到菌體干濕重大小。使用峰面積對碳濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線(回歸系數(shù)R2=0.99)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式為

y=16.591x+8.9933

(3)

式中：其中回歸系數(shù)為R2=0.9998；x為時間，min[15]。

2 調(diào)控結(jié)果

2.1 低濃度調(diào)控結(jié)果

不同菌種類型會產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，而同一種菌種在產(chǎn)生代謝產(chǎn)物時，對應(yīng)最佳菌體的重量也不同，調(diào)控微生物轉(zhuǎn)化時，控制3種不同濃度的碳源，統(tǒng)計(jì)調(diào)控6天培養(yǎng)基，得到的低碳濃度的菌體干濕重變化見圖2。

圖2 低濃度碳源菌體干濕重變化

由圖2可知:控制低碳源濃度為0～35000mg/L時，隨著時間的增長，菌體濕重穩(wěn)步增長，在約126h時，濕重開始減小，最終維持在38～40g之間。菌體在78h時，干重開始下降，但在90h時，又恢復(fù)穩(wěn)固上升的趨勢。

2.2 中濃度調(diào)控結(jié)果

維持中濃度碳源在7000～42000mg/L，隨著水分的蒸發(fā)，前幾個小時菌體生長旺盛，菌液黏稠。將通氣調(diào)至最高，補(bǔ)加水增強(qiáng)控制菌的攝氧率，增強(qiáng)有機(jī)污染物微生物轉(zhuǎn)化代謝過程。中濃度碳源菌體干濕重變化見圖3。

圖3 中濃度碳源菌體干濕重變化

由圖3可知:維持中濃度碳源，在96h時，菌體濕重大小發(fā)生小轉(zhuǎn)折，但依舊保持上升趨勢；而此時的菌體干重并沒有發(fā)生明顯變化，最終維持在10g左右。

2.3 高濃度調(diào)控結(jié)果

增加碳源種類，將碳源濃度保持在21000～56000mg/L的高濃度區(qū)間內(nèi)，菌體在此濃度下，自體產(chǎn)生自行代謝，并產(chǎn)生大量的前體，此時的菌體干濕重量變化見圖4。

圖4 高濃度碳源菌體干濕重變化

由圖4可知:維持高濃度碳源，菌體在20h時，濕重逐漸增加，大小增長到40g。而干重保持增長，到120h時，干重大小變?yōu)?0g，之后干重減小，實(shí)驗(yàn)完畢后，菌體干重維持在10g左右。

3 結(jié) 論

3.1 保持低碳濃度環(huán)境

在培養(yǎng)基發(fā)酵后期，菌體生長緩慢，殘?zhí)橇枯^低。維持正常代謝過程時需要足夠的碳骨架，碳骨架會產(chǎn)生代謝過程的關(guān)鍵中間體FGFC3，但在低碳濃度環(huán)境下的合成能力較低，所以代謝過程在72h時，F(xiàn)GFC3開始積累，才可以維持正常的代謝過程，調(diào)控方式基本奏效。在124h之后，由于殘?zhí)橇窟^低，培養(yǎng)基發(fā)酵液環(huán)境內(nèi)的pH值迅速升高，導(dǎo)致代謝所需的FGFC3無法正常產(chǎn)生，破壞了發(fā)酵體系。此時的菌體濕重、干重波動較大，調(diào)控效果最明顯。

3.2 保持中濃度碳環(huán)境

在20h時，逐漸產(chǎn)生FGFC3，沒有出現(xiàn)二次積累，并隨著時間的持續(xù)積累呈現(xiàn)出一種小幅度的波動變化。中碳濃度的調(diào)控環(huán)境，可以提供足夠的碳骨架，幫助產(chǎn)生更多的FGFC3。但剩下的中濃度碳源會在一段時間內(nèi)，打破代謝平衡。隨著時間的增加，代謝會產(chǎn)生一種由正常代謝到打破正常代謝，最終又恢復(fù)正常代謝的循環(huán)過程，導(dǎo)致圖2中濕重不斷增加、干重基本保持不變的情況。調(diào)控效果不明顯，基本不影響水環(huán)境有機(jī)污染物微生物的轉(zhuǎn)化。

3.3 調(diào)節(jié)到高濃度碳環(huán)境

代謝過程中的酶會將鳥氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，瓜氨酸參與到代謝過程中反應(yīng)，轉(zhuǎn)換形成精氨琥珀酸，然后在酶的催化下，裂解水解后形成尿素，加快了代謝過程。所以在72h之后，殘?zhí)橇康停邼舛鹊奶荚磿铣筛嗟腇GFC3，剩余的碳源會因?yàn)闈舛冗^高，經(jīng)干燥后增加了菌體的干重。在120h時，經(jīng)過干燥后的碳會變成區(qū)別于菌體的黑色固體，去除殘余的黑色碳，得到菌體干重大小變化。因此,高濃度調(diào)控環(huán)境，代謝調(diào)控效果一般。

4 結(jié) 語

在當(dāng)今蓬勃發(fā)展的社會，疏忽對環(huán)境的保護(hù)，會造成環(huán)境的污染。研究水環(huán)境有機(jī)污染物微生物轉(zhuǎn)化的代謝調(diào)控，可以更科學(xué)地治理被有機(jī)污染物污染的水環(huán)境，更加全面地研究水環(huán)境內(nèi)存在的有機(jī)污染物，有助于水環(huán)境的治理，使經(jīng)濟(jì)發(fā)展與環(huán)境發(fā)展相協(xié)調(diào)，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展。