趙 颯 時(shí)藝珊

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 沈陽(yáng) 110002）

營(yíng)養(yǎng)相關(guān)性疾病的代謝程序化研究是當(dāng)今世界生命科學(xué)研究的前沿領(lǐng)域，許多流行病學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明孕期營(yíng)養(yǎng)對(duì)機(jī)體組織結(jié)構(gòu)和各系統(tǒng)功能發(fā)育都發(fā)揮著重要作用，關(guān)系到個(gè)體生命的生長(zhǎng)和成年期糖尿病、肥胖癥等慢性病的發(fā)生[1]。有研究證明，高蛋白飲食可以減少脂肪合成和肥胖[2]。但孕早期高蛋白飲食對(duì)子代肥胖影響的研究少有報(bào)道。所以，本研究從生命早期（胚胎期和斷乳后）的飲食入手，探討早期高蛋白飲食對(duì)大鼠肥胖及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因表達(dá)產(chǎn)生何種影響，動(dòng)態(tài)觀察作用的持續(xù)性，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)Wistar大鼠(購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物科技股份有限公司)，40只，體質(zhì)量320～370 g。

1.1.2 飼料：參考美國(guó)官方分析化學(xué)師協(xié)會(huì)（AOAC）配方配置基礎(chǔ)飼料，基礎(chǔ)飼料組成：豬油5（g/100 g）；酪蛋白20（g/100 g）；玉米淀粉63（g/100 g）；混合無(wú)機(jī)鹽3.5（g/100 g）；混和維生素1.5（g/100 g）；膳食纖維1（g/100 g）。高蛋白飼料組成：豬油5（g/100 g）；酪蛋白40（g/100 g）；玉米淀粉44（g/100 g）；混合無(wú)機(jī)鹽3.5（g/100 g）；混和維生素1.5（g/100 g）；膳食纖維1（g/100 g）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理：選取40只雌性受孕Wistar大鼠，隨機(jī)分為高蛋白飲食組（HPG）20只及正常飲食組（NG）20只，分娩后胎仔由妊娠期間正常飲食的母鼠喂哺，斷乳后給予正常飲食至出生后8周，每組再分為兩個(gè)亞組（1、2），分別給予高脂飲食（HPG-1、NG-1）和正常飲食（HPG-2、NG-2），再持續(xù)6周，分別記錄每組動(dòng)物的體質(zhì)量。分別在剛出生、出生后8周、出生后14周等不同時(shí)期處死動(dòng)物，取出白色脂肪，0.1%DEPC 水處理，放于-80 ℃冰箱長(zhǎng)保存，用RTPCR法檢測(cè)PEPCK基因的水平。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器和所用試劑：RT-PCR試劑盒和Trizol 總RNA 提取試劑購(gòu)自大連TaKaRa 寶生物技術(shù)有限公司；DNA Marker 采用TakaRa 公司DL2000；Uv-120型（日本）紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 純度；美國(guó)Gelwork 2000圖像掃描系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。

1.2.3 RT-PCR測(cè)定：取白色脂肪組織100 mg，用RNA 提取試劑盒提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量、計(jì)算RNA純度及濃度。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，1 μL cDNA 為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系10 μL，最佳退火溫度均為60 ℃。目的基因PEPCK 引物序列為：上游：5'-GGTTAGTTATGCCCAGGATCAGC -3'；下游：5'-GAACTCACTGCTTGGGAAGAAATG -3'。內(nèi)參照物β-actin 引物序列為：上游：5'-CGCTCATTGCCGATAGTG -3'，下游：5'-AGGGAAATCGTGCGTGAC -3'。

表1 各組體質(zhì)量變化（g，±s）

表1 各組體質(zhì)量變化（g，±s）

注：#P＜0.05 vs HP組，*P＜0.05 vs HPG-1組，*#P＜0.05 vs NG-1組

表2 各組大鼠PEPCK基因mRNA表達(dá)量（PEPCK/β-actin，±s）

表2 各組大鼠PEPCK基因mRNA表達(dá)量（PEPCK/β-actin，±s）

注：組間#P ＜0.05，*P＜0.05 vs HPG-1組，&P＜0.05 vs HPG-2組

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異采用方差分析進(jìn)行處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同飲食組的大鼠在不同時(shí)期體質(zhì)量對(duì)比：高蛋白組（HPG）大鼠分娩后胎仔體質(zhì)量、出生后8周體質(zhì)量均明顯低于正常飲食組（NG），對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；出生后14周，HPG-1組雖然經(jīng)歷一段時(shí)間的正常飲食，但8周后再予高蛋白飲食后，體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯低于HPG-2組、NG-1組、NG-2組，比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；出生后14周，NG-1組8周后改為高蛋白飲食，體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯低于NG-2組，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 高蛋白飲食對(duì)不同時(shí)期大鼠白色脂肪中PEPCK mRNA表達(dá)量的影響：在剛出生、出生后8周，高蛋白組（HPG）PEPCK mRNA表達(dá)量明顯低于正常飲食組（NG），在出生后14周，亞組間對(duì)比（HPG-1組與HPG-2組對(duì)比及NG-1組與NG-2組對(duì)比），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；出生后14周，HPG-1組PEPCK mRNA表達(dá)量低于HPG-2組、NG-1組、NG-2組，比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；出生后14周，HPG-2組雖然一直給予正常飲食，但PEPCK mRNA表達(dá)量仍低于NG-1組、NG-2組，對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2、圖1。

圖1 各組大鼠PEPCK基因mRNA表達(dá)量對(duì)比圖

3 討 論

肥胖是指一定程度的明顯超重與脂肪層過(guò)厚，是體內(nèi)脂肪，尤其是三酰甘油積聚過(guò)多而導(dǎo)致的一種狀態(tài)。它與高血壓、冠心病、腦血管疾病、糖尿病、脂質(zhì)代謝紊亂、腫瘤等的發(fā)生有密切的關(guān)系，并是這些疾病高發(fā)的重要危險(xiǎn)因素[3-4]。目前肥胖的發(fā)病率越來(lái)越高，已成為世界范圍內(nèi)最受注目的營(yíng)養(yǎng)性疾病之一，并成為研究的熱點(diǎn)。肥胖是環(huán)境與遺傳因素相互作用的結(jié)果。孕期營(yíng)養(yǎng)是主要環(huán)境因素，早期飲食可以持續(xù)影響機(jī)體的代謝，使機(jī)體對(duì)早期經(jīng)歷產(chǎn)生記憶，進(jìn)而影響成年時(shí)肥胖的發(fā)生[5-7]。因此，孕期飲食較成年飲食與基因的相互作用對(duì)肥胖的發(fā)生、發(fā)展具有更重要的意義。

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）是以一條單一肽鏈構(gòu)成，相對(duì)分子質(zhì)量為740千道爾頓的一種激酶，是糖異生和脂肪酸再酯化的關(guān)鍵酶，在PEPCK的作用下，3-磷酸甘油（G3P）與活化的脂肪酸酯化為甘油三脂（TG）儲(chǔ)存在脂肪細(xì)胞內(nèi)[8]。當(dāng)飼料中蛋白質(zhì)比例增高、碳水化合物比例減少時(shí)，導(dǎo)致PEPCK基因的水平下降，說(shuō)明高蛋白飲食組的大鼠可以通過(guò)降低糖異生和甘油異生而降低肥胖的發(fā)生[9-10]。

本研究發(fā)現(xiàn)在孕鼠階段給予高蛋白飲食，可以降低出生后PEPCK mRNA表達(dá)量，雖然出生后恢復(fù)正常飲食，但其后代不同時(shí)段檢測(cè)PEPCK基因呈持續(xù)低表達(dá)，并且當(dāng)成年后再次給予高蛋白飲食后，PEPCK mRNA表達(dá)量進(jìn)一步減低。說(shuō)明孕期飲食程序化影響著后代PEPCK基因的表達(dá)，并持續(xù)影響成年后肥胖的發(fā)生，為早期預(yù)防和控制肥胖提供科學(xué)依據(jù)。