冉玉琴,陳 雨,彭 杰,董 鋒,楊國華,張 良,*

(1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,食品生物技術(shù)四川省高校重點實驗室,四川成都 610039; 2.四川品品食品有限公司,四川成都 611732; 3.四川省丹丹郫縣豆瓣集團股份有限公司國家企業(yè)技術(shù)中心,四川省豆瓣釀制工程實驗室,食品用酶生物發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,四川成都 611732)

郫縣豆瓣是一種中國傳統(tǒng)地方特色發(fā)酵食品,主要是由二荊條辣椒、蠶豆、小麥粉和鹽等原料制成[1-2],以其味辣香醇、黏稠絨實、紅棕油亮、醬香濃郁等特點，在我國醬類產(chǎn)品中獨樹一幟,是川菜中重要的調(diào)味料,被譽為“川菜之魂”[3]。作為一種極具地方特色的發(fā)酵型調(diào)味品,其特殊的發(fā)酵工藝、原料及環(huán)境因素造就了郫縣豆瓣獨特的風(fēng)味品質(zhì)[4]。郫縣豆瓣的生產(chǎn)工藝包括前發(fā)酵和后發(fā)酵2個階段:前期發(fā)酵主要是指蠶豆霉瓣子的制曲和辣椒坯的預(yù)處理,制作周期分別為40 d和6個月左右。后熟發(fā)酵主要是將成熟霉瓣子和成熟辣椒坯按比例配料混合,加入適量食鹽和水,進入發(fā)酵池發(fā)酵,經(jīng)過一定時期的翻曬和陳化,經(jīng)過郫縣豆瓣特有的翻、曬、露工藝成為深受歡迎的產(chǎn)品。紅豆瓣成熟其為6個月到1年左右,成熟一年以上為黑豆瓣[5]。

脂肪作為郫縣豆瓣不可或缺的部分,賦予其油亮的特性,增加人民群眾的消費意向。在發(fā)酵過程,大量微生物分泌的相關(guān)酶系將脂肪分解成脂肪酸和甘油[6]。有研究表明,攝入適當(dāng)比例的飽和、單不飽和、多不飽和脂肪酸可預(yù)防心腦血管疾病、癌癥、關(guān)節(jié)炎等[7];脂肪酸作為郫縣豆瓣一些風(fēng)味物質(zhì)的前體成分,更是醛類、醇類、呋喃類等的重要來源[8]。

郫縣豆瓣作為一種國家地理標(biāo)志產(chǎn)品,國外對于它的研究幾乎沒有。目前,國內(nèi)對于郫縣豆瓣的研究主要集中在香氣成分分析[9-10]、后發(fā)酵期真菌細菌的演替變化分析[11-12]和黃曲霉毒素的分析[13]以及有機酸[14]、氨基酸[15]的種類及含量的研究分析。針對郫縣豆瓣脂肪酸的報道較少,僅有部分涉及揮發(fā)性脂肪酸[16],但沒有對不同發(fā)酵時間點郫縣豆瓣的脂肪酸進行定量及比對分析。因此,本課題通過追蹤8個不同后發(fā)酵時間的郫縣豆瓣,利用氣相色譜儀測定其脂肪酸的種類和含量,采用主成分分析法研究其組成差異,以期為郫縣豆瓣后發(fā)酵工藝改良提供科學(xué)依據(jù),也為進一步挖掘地域特色發(fā)酵產(chǎn)品的科技內(nèi)涵提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

郫縣豆瓣 取自四川省丹丹郫縣豆瓣集團股份有限公司生產(chǎn)車間;石油醚(60～90 ℃)、硫酸、甲醇、正己烷 均為分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司;十一碳酸甘油三酯、37種脂肪酸甲酯 均為色譜純,斯坦福分析化學(xué)公司。

超低溫冰箱 美國Thermo Fisher Scientific公司;TNG-T98型真空干燥儀 太倉市華美生化儀器廠;JXFSTPRP-24型研磨儀 上海警信科技有限公司;Forma 900 series型全自動索氏抽提儀 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;XW-80A型渦旋混合器 四川蜀科儀器有限公司;7820A型氣相色譜儀 美國安捷倫科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 采樣及預(yù)處理 分別選取后發(fā)酵1、3、6、9、12、18、24和36月(M)的郫縣豆瓣,取樣時選取上層(距表面0～20 cm)、中層(距表面30～50 cm)、下層(距池底0～20 cm)的郫縣豆瓣,混合均勻后密封,4 ℃低溫運至實驗室。經(jīng)冷凍干燥后,粉碎備用。

1.2.2 粗脂肪的提取 采用GB 5009.6-2016《索氏抽提法》[17],準(zhǔn)確稱取2.00 g樣品于索氏提取儀,加入60 mL石油醚;提取條件為:溫度75 ℃,經(jīng)浸泡20 min、淋洗60 min、回收溶劑10 min、蒸干5 min后取出,80 ℃烘干至恒重,計算粗脂肪含量。

式中:A0為豆瓣粉樣品質(zhì)量,mg;A1為浸提杯質(zhì)量,mg;A2為含有豆瓣油脂的浸提杯的質(zhì)量,mg。

1.2.3 脂肪酸分析 甲酯化反應(yīng)[18]:稱取0.01 g上述油脂于10 mL具塞試管中,加入1 mL 2.5 mol/L內(nèi)標(biāo)溶液(十一碳酸甘油三酯)與3 mL 2.5 mol/L 硫酸-甲醇溶液,70 ℃水浴加熱至油樣溶解。期間每10 min渦旋振蕩30 s,冷卻至室溫后加入1 mL正己烷多次振蕩萃取,合并上清液過0.2 μm微孔濾膜后待測。

1.2.4 色譜條件 氣相色譜儀配備FID 檢測器;ZB-FAME毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.2 μm);檢測器溫度280 ℃;升溫程序:50 ℃保持2 min,以8 ℃/min 升溫至180 ℃,保持5 min后,以5 ℃/min 升溫至230 ℃,保持5 min;載氣為氫氣,流速1.2 mL/min;燃氣為氫氣,流速30 mL/min;空氣流速300 mL/min,輔助氣體為氮氣,流速25 mL/min。根據(jù)混合標(biāo)準(zhǔn)品確定保留時間,以十一碳酸甘油三酯為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進行分析處理。

式中:Xi為試樣中脂肪酸甲酯i含量(g/100 g);Fi為脂肪酸甲酯i的響應(yīng)因子;Ai為試樣中脂肪酸甲酯i的峰面積;AC11為試樣中加入的內(nèi)標(biāo)物十一碳酸甲酯峰面積;ρC11為十一碳酸甘油三酯濃度(mg/mL);VC11為試樣中加入十一碳酸甘油三酯體積(mL);1.0067為十一碳酸甘油三酯轉(zhuǎn)化成十一碳酸甲酯的轉(zhuǎn)換系數(shù);m為試樣的質(zhì)量(mg)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗設(shè)3次重復(fù),測定結(jié)果以平均值(誤差的形式表示。數(shù)據(jù)處理用SPSS 19.0軟件進行方差分析(ANOVA)與主成分分析,通過Pearson相關(guān)系數(shù)分析脂肪酸之間的相關(guān)性,采用Origin 18.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同后發(fā)酵期郫縣豆瓣的粗脂肪含量

如圖1為不同后發(fā)酵期郫縣豆瓣粗脂肪含量,結(jié)果表明:粗脂肪在后發(fā)酵期間變化不大,含量為3.46%～4.29%(w/w),與豆醬(4.26%)[19]、醬油(6.15%)[20]等其他豆類發(fā)酵調(diào)味品含量差異不大。隨著后發(fā)酵進行,粗脂肪含量呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢,究其原因,可能是前期微生物演替過程比較劇烈,消耗了大量的粗脂肪,但隨著代謝的減弱、酶系的作用以及郫縣豆瓣特有的“翻、曬、露”工藝,使得郫縣豆瓣中大量的可溶物溢出,導(dǎo)致了粗脂肪的含量變化。

圖1 不同后發(fā)酵時期郫縣豆瓣醬的粗脂肪含量Fig.1 Fat contents of Pixian soybean pasteduring different post-fermentation stages

有報道表明,假單孢菌[21]、葡萄球菌以及一些曲霉[22]都具有一定產(chǎn)脂肪酶的能力,這些微生物在郫縣豆瓣后發(fā)酵期也廣泛存在[12,23],這可能造成了郫縣豆瓣粗脂肪的減少。另外,脂肪酶屬于羧基水解酶類,能將天然底物油脂逐步地水解成甘油、脂肪酸和甘油單酯或二酯[24]。隨著后發(fā)酵進行,可溶物的溶出、pH的降低[25]、溫度隨季節(jié)天氣的變化[26]等,都會影響微生物代謝脂肪酶的能力以及脂肪酶的活性。

2.2 不同后發(fā)酵期郫縣豆瓣的脂肪酸組成

圖2為6個月后發(fā)酵期郫縣豆瓣樣品的氣相色譜圖。表1為8個不同后發(fā)酵時期的郫縣豆瓣樣品中脂肪酸組成。由表1可知,不同后發(fā)酵期的郫縣豆瓣樣品共檢出9種脂肪酸,含量存在一定差異?？傊舅岢尸F(xiàn)先下降后上升再下降后上升的動態(tài)變化,這與韓國大醬持續(xù)升高存在差異[27]。這可能是由于制作韓國大醬和郫縣豆瓣醬的原輔料、發(fā)酵工藝以及微生物區(qū)系的不同所導(dǎo)致的。在24～36 M,脂肪酸含量上升幅度較大,可能是郫縣豆瓣特有的長時間“翻、曬、露”工藝,使得水分含量減少,導(dǎo)致其含量升高。

表1 不同后發(fā)酵時期郫縣豆瓣脂肪酸組成及含量(mg/g)Table 1 Fatty acid composition and contents of Pixian soybean paste at different post-fermentation stages(mg/g)

圖2 郫縣豆瓣樣品中脂肪酸組分氣相色譜圖 Fig.2 Gas chromatogram of fatty acid componentsin Pixian soybean paste samples注:1:十一碳酸甘油三酯(11.587 min);2:月桂酸甲酯(12.725 min);3:肉豆蔻酸甲酯(14.841 min);4:棕櫚酸甲酯(16.781 min);5:棕櫚油酸甲酯(17.148 min);6:硬脂酸甲酯(18.574 min);7:油酸甲酯(18.859 min);8:反式油酸甲酯(18.935 min);9:亞油酸甲酯(19.511 min);10:亞麻酸甲酯(20.427 min)。

不同后發(fā)酵期郫縣豆瓣脂肪酸,含量最高的是亞油酸(4.963～11.668 mg/g),依次是油酸(1.186～2.706 mg/g)和棕櫚酸(0.751～1.649 mg/g),這與豆豉(亞油酸55.941%、油酸21.592%、棕櫚酸13.729%)[28]的含量相似。脂肪酸含量普遍較低的是月桂酸(0.030～0.113 mg/g)、肉豆蔻酸(0.131～0.305 mg/g)、棕櫚油酸(0.056～0.142 mg/g)、反式油酸(0.126～0.230 mg/g),反式油酸和棕櫚油酸在整個后發(fā)酵期間含量變化不大,處于一個相對穩(wěn)定的狀態(tài);月桂酸和肉豆蔻酸呈起伏變化;不飽和脂肪酸亞油酸、油酸、亞麻酸呈整體下降趨勢。

在1～6 M期間,脂肪酸含量逐步下降,并在6 M處達到最低值,究其原因,一方面可能是原料蠶豆瓣中含有一定量的脂肪酸;另一方面可能是來自于微生物與酶的作用,使1 M脂肪酸含量較高。但隨著發(fā)酵的進行,部分微生物由于不適應(yīng)新的環(huán)境或完成其代謝過程而消失[8],使得脂肪酸的形成減緩。直至發(fā)酵6 M時,“翻、曬、露”過程中大量環(huán)境微生物的進入,使郫縣豆瓣發(fā)酵體系達到一個相對穩(wěn)定的狀態(tài),致使脂肪酸含量在此時到達最低點。

亞油酸(C18∶2)是郫縣豆瓣發(fā)酵過程中含量最豐富的多不飽和脂肪酸,相對百分比含量高達56.90%～69.60%。亞油酸可降低氧化損傷,通過與膽固醇結(jié)合,還可維持血液膽固醇正常的運轉(zhuǎn)和代謝、預(yù)防動脈粥樣硬化、糖尿病和心腦血管疾病[29-32]。此外,亞油酸和油酸不僅是必需脂肪酸,也可通過氧化、酶系作用分解生成醛類、醇類、酮類及呋喃類化合物[7],適量的油酸和亞油酸含量可顯著增加揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成及總量,過高則易產(chǎn)生不愉快氣味[33],對于郫縣豆瓣醬獨特風(fēng)味物質(zhì)生成具有一定貢獻。

2.3 不同后發(fā)酵期郫縣豆瓣脂肪酸相關(guān)性分析

為了更直觀的解釋后發(fā)酵過程中郫縣豆瓣樣品中脂肪酸的變化情況,對8個郫縣樣品9種脂肪酸成分進行相關(guān)性分析,結(jié)果如表2所示。大部分脂肪酸含量之間存在正相關(guān)關(guān)系(僅1個負相關(guān)),且相關(guān)系數(shù)大多大于0.5,表明脂肪酸之間具有較強的正相關(guān)性。硬脂酸、油酸、反式油酸、棕櫚油酸等脂肪酸之間存在極顯著正相關(guān)(P<0.01);肉豆蔻酸與硬脂酸、油酸、反式油酸、亞油酸存在顯著正相關(guān)(P<0.05),與亞麻酸呈極顯著正相關(guān)(P<0.01);棕櫚油酸與亞油酸呈顯著正相關(guān)(P<0.05);棕櫚酸、月桂酸與其他脂肪酸均不存在顯著相關(guān)性。由于指標(biāo)之間均存在不同程度的相關(guān)性,所以可以利用主成分分析對這些變量即原始的脂肪酸含量進行降維處理,來研究豆瓣中脂肪酸與不同后發(fā)酵時期的關(guān)系。主成分的特征值和貢獻率見表3。由表3可知,前2個主成分的貢獻率分別為75.09%、15.21%,累積貢獻率為90.30%,確定提取2個主成分最合適,可較好反映所有脂肪酸組成的基本信息。

表2 脂肪酸指標(biāo)間的皮爾森相關(guān)系數(shù)Table 2 Pearson correlation coefficient between fatty acid indicators

表3 主成分的特征值和貢獻率Table 3 Eigen values and contribution rateand of the principal components

主成分的載荷矩陣見表4。由表3和表4各特征向量值可知,第一主成分PC1主要反映C18∶1t、C18∶0、C18∶1的變異信息,故可將PC1命名為十八碳脂肪酸因子F1。第二主成分主要反映C12∶0和C16∶0的變異信息,故可將PC2命名為飽和脂肪酸因子F2。

表4 主成分載荷矩陣Table 4 Loading matrix of principal components

圖3為主成分分析得到的不同發(fā)酵期脂肪酸組分的分值圖。從圖3可以看出,不同樣品在橫、縱坐標(biāo)的距離各不相同且沒有重疊,說明8個不同后發(fā)酵期郫縣豆瓣樣品得到了較好的區(qū)分。其中,樣品在坐標(biāo)上的距離隨時間變化而變化,因而可大致將后發(fā)酵期脂肪酸的變化分為三個階段,分別為后發(fā)酵前期(1～3 M)、中期(6～9 M)、后期(12～36 M),并且隨著發(fā)酵時間的延長脂肪酸變化程度減弱,究其原因,可能是由于在后發(fā)酵前期,各種微生物與酶系的作用代謝過程較快,僅相隔一兩個月其脂肪酸含量都存在顯著差異;隨著發(fā)酵的進行,底物的消耗及pH的降低[28]，影響發(fā)酵體系中相關(guān)酶活性及微生物產(chǎn)酶能力,導(dǎo)致后發(fā)酵中期、后期脂肪酸含量變化逐漸減緩。

圖3 郫縣豆瓣后發(fā)酵過程中脂肪酸組分的分值圖Fig.3 Score plots of fatty acid compositionduring post-fermentation of Pixian soybean paste

3 結(jié)論

郫縣豆瓣在后發(fā)酵過程中粗脂肪含量變化為3.46%～4.29%，其中飽和脂肪酸以棕櫚酸為主,不飽和脂肪酸以亞油酸、油酸為主,且不飽和脂肪酸含量遠遠高于飽和脂肪酸,另外還含有少量其他種類脂肪酸如:月桂酸、亞麻酸、棕櫚油酸、硬脂酸等?；谥鞒煞址治龇?提取得到前兩個主成分貢獻率分別為75.09%、15.21%,累積貢獻率達90.30%,可較好反映所有脂肪酸組成的基本信息。脂肪酸含量在后發(fā)酵期的變化可大致分為三個階段,依次分別為1～3、6～9、12～36 M,可稱為后發(fā)酵前期、發(fā)酵中期和發(fā)酵后期。在發(fā)酵過程中,一些不飽和脂肪酸還可氧化分解為揮發(fā)性香味物質(zhì),對后發(fā)酵過程中香氣成分的變化具有潛在影響。相對于郫縣豆瓣中其他呈香呈味物質(zhì)(氨基酸、有機酸),部分發(fā)酵節(jié)點上脂肪酸的含量相對稍高。本研究結(jié)果為郫縣豆瓣工業(yè)化生產(chǎn)控制產(chǎn)品品質(zhì)與建立生產(chǎn)質(zhì)量控制體系提供了科學(xué)依據(jù)。同時脂肪酸還是一些霉菌的代謝物質(zhì),要系統(tǒng)闡明發(fā)酵過程中脂肪酸的代謝通道，還需結(jié)合發(fā)酵過程中參與轉(zhuǎn)化的真菌細菌進一步研究。