劉鶴祥,喬 羽,王如福

(山西農業(yè)大學食品科學與工程學院,山西太谷 030801)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld)被聯(lián)合國糧農組織(FAO)推薦為最適合人類食用的全營養(yǎng)食品,研究表明藜麥單體植物即可滿足人體的基本營養(yǎng)需求[1-2]。藜麥具有遠超于其他谷物的營養(yǎng)價值,其蛋白質平均含量高達16.5%,其中主要有白蛋白(35%)和球蛋白(37%),淀粉含量約占藜麥籽實總重的55%～69%,且富含植物中普遍缺乏的賴氨酸、鈣、鎂、磷、鉀、鐵、鋅、硒、錳、銅等[3-5]。眾多研究[6-8]表明,藜麥的抗氧化性、降血糖功能、抗癌活性、降血脂及抗炎活性主要來源于藜麥中的黃酮類物質、植物多酚、蛻皮激素及藜麥皂苷等功能物質,故藜麥對人體代謝、腸胃功能、心腦血管均有明顯益處[9-12]。

目前國內外的研究主要集中在藜麥的種植技術[13]、品質改良[14]、營養(yǎng)開發(fā)及功能成分提取[15-17]等方面。對于營養(yǎng)豐富的藜麥,已經(jīng)不僅限于對其單獨某種營養(yǎng)成分的提取,研究者更傾向于開發(fā)藜麥加工食品,其中藜麥發(fā)酵產品的研究也在日益增加,陳樹俊等[18]利用植物乳桿菌及干酪乳桿菌發(fā)酵藜麥芽制成藜麥芽乳,卞猛[19]則研究了藜麥啤酒的釀造工藝等。藜麥中含有較多的活性功能成分,如果能在發(fā)酵產品中最大程度地保留這些物質,將更有利于實現(xiàn)最終產品的功能化。

糖化過程是調配型和發(fā)酵型藜麥產品制備過程中的重要環(huán)節(jié),也是容易使功能成分損失的環(huán)節(jié),糖化的目的是將藜麥等谷物淀粉轉換成可供微生物發(fā)酵代謝的糖化醪[20],目前的研究主要集中在提高糖化醪中的還原糖含量,使糖化醪具有良好的發(fā)酵性能,如孫蕾等[21]對小米飲料的糖化工藝及產品穩(wěn)定性進行優(yōu)化提高了糖化醪的含糖量,郭克娜等[22]優(yōu)化薏米酒發(fā)酵前的糖化過程得到還原糖含量達6.87 g/100 mL的糖化醪,李貞景等[23]同樣以葡萄糖當量值作為評價標準進行了藜麥糖化工藝的優(yōu)化。眾多研究都通過提高還原糖含量來提升糖化醪的發(fā)酵性能,但是糖化醪還原糖含量只要大于8.0 g/100 mL時即能滿足大多數(shù)發(fā)酵產品前期對糖含量的要求;而像藜麥、小米、薏米等一些功能性谷物在產品開發(fā)的過程中,有必要將其功能成分也作為評價標準。對功能性谷物發(fā)酵行業(yè)來說,保留更多有益成分的糖化工藝優(yōu)化研究對產品質量的提升有重要意義。

本實驗以藜麥為原料,以還原糖含量及總黃酮含量作為評價指標制備藜麥糖化醪。采用單因素試驗、Plackett-Burman試驗和響應面法優(yōu)化藜麥的糖化工藝,旨在為研發(fā)藜麥發(fā)酵食品提供新的前期加工思路,同時進一步提高藜麥發(fā)酵產品的質量,實現(xiàn)最終產品的功能化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白色藜麥(總黃酮含量為240 mg/100 g) 山西靜山樂水農業(yè)開發(fā)有限公司;α-淀粉酶(40000 U/g)、糖化酶(100000 U/g)、蘆丁標準品(純度≥98%) 北京索萊寶科技有限公司。

THZ-82恒溫振蕩水浴鍋 常州潤華電器有限公司;BS210S電子天平 德國賽多利斯集團;722可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;79-1磁力加熱攪拌器 常州潤華電器有限公司;STARTER3100數(shù)顯pH儀 上海奧豪斯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藜麥糖化工藝流程 藜麥種子→挑選→清洗→浸泡發(fā)芽→水浴鍋蒸煮糊化→加入α-淀粉酶→加熱滅酶→加入糖化酶→加熱滅酶→藜麥糖化醪

挑選顆粒飽滿、無霉變的藜麥100 g,置于500 mL錐形瓶中,加入藜麥重量150%的水浸泡12 h使籽實萌芽,萌芽使藜麥種子的脂肪和淀粉含量降低,黃酮含量及蛋白質含量升高,有利于提高藜麥糖化醪的功能性,并且浸泡后的藜麥種子更容易糊化;將發(fā)芽后的藜麥置于恒溫水浴鍋中加適量的水進行糊化;升溫過程中加入α-淀粉酶,達到作用時間后升溫至100 ℃保持30 s滅酶;降溫時加入糖化酶,達到作用時間后升溫至100 ℃保持30 s滅酶,冷卻得到藜麥糖化醪。

1.2.2 藜麥糖化單因素試驗 以總黃酮含量及還原糖含量為指標,固定因素水平為糊化溫度80 ℃,糊化時間30 min,α-淀粉酶添加量為800 U/g,液化溫度為70 ℃,液化時間為20 min,糖化酶添加量為3000 U/g,糖化溫度為60 ℃,糖化時間為40 min。設置單因素試驗:加水量(300%、400%、500%、600%、700%)、糊化溫度(60、70、80、90、100 ℃)、糊化時間(20、30、40、50、60 min)、α-淀粉酶添加量(0、400、800、1200、1600 U/g)、液化溫度(60、70、80、90、100 ℃)、液化時間(10、20、30、40、50 min)、糖化酶添加量(1000、2000、3000、4000、5000 U/g)糖化溫度(55、60、65、70、75 ℃)、糖化時間(30、40、50、60、70 min)9個因素對糖化終點還原糖及總黃酮含量的影響。

1.2.3 Plackett-Burman聯(lián)用Box-Behnken響應面法優(yōu)化藜麥糖化工藝 基于單因素試驗的結果,通過Plackett-Burman試驗分別從9個影響因素中篩選出對藜麥糖化醪還原糖含量及總黃酮含量影響的4個顯著因素分別為X1、X2、X3、X4,然后以藜麥糖化醪的總黃酮含量及還原糖含量的綜合評分為指標,采用中心組合Box-Behnken Design(BBD)設計試驗進行響應面優(yōu)化藜麥的糖化工藝。根據(jù)PB試驗分別以藜麥糖化醪的還原糖含量及總黃酮含量為評價指標進行響應面中心組合試驗,響應面試驗設計見表1。

表1 響應面試驗因素及水平Table 1 Experimental factors and levelsused inresponse surface methodology

1.2.4 總黃酮含量的測定 依據(jù)GB/T 19777-2013分光光度比色法測定,再利用標準曲線計算。

以蘆丁為標準物,NaNO2-Al(NO3)3比色法建立標準曲線回歸方程:y=0.4668x+0.0074,R2=0.9985。其中,y為吸光值,x為蘆丁質量。

式中:X表示樣品中總黃酮(以蘆丁計)的含量,mg/100 mL;m1表示用回歸方程計算試液中總黃酮(以蘆丁計)的質量,mg;m表示樣品的質量,g。

1.2.5 還原糖含量測定 葡萄糖標準曲線法:分別取葡萄糖標準液(1 mg/mL)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于25 mL試管中,分別準確加入DNS試劑1.5 mL,用蒸餾水補至2 mL,沸水浴加熱5 min,流水冷卻,定容,超聲3 min,在510 nm波長下測定吸光度[24]。葡萄糖的標準曲線回歸方程為:y=1.5429x-0.0214,R2=0.9984。

1.2.6 雙響應值響應面分析 SPSS 17.0軟件分析結果如表2所示,皮爾遜系數(shù)(pearson correlations)r<0時表示兩個變量為負相關,當|r|≥0.8時表示兩變量高度相關,0.8≥|r|≥0.5時表示兩變量中度相關,|r|≤0.5時表示兩變量低度相關,試驗中r=-0.651表示兩變量還原糖含量及總黃酮含量中度線性負相關,無法對兩個響應值進行線性擬合,故本試驗先對兩個負相關的響應值按照預定的評分標準進行綜合評分,評分標準見表3,根據(jù)綜合評分的結果進行響應面分析。

表2 還原糖含量及總黃酮含量的相關性分析Table 2 Relative analysis of reducing sugarcontent and total flavonoids content

表3 評分標準Table 3 Scoring rules

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗中每個處理均重復3次。數(shù)據(jù)顯示為平均值±標準偏差,結果采用Excel、Origin 2018軟件進行單因素試驗數(shù)據(jù)分析和圖表繪制,采用SPSS17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析,采用Design-Expert 8.0軟件進行Plackett-Burman試驗及響應面試驗的統(tǒng)計分析,差異顯著性水平設為P<0.05。

2 結果與討論

2.1 藜麥糖化單因素試驗結果

2.1.1 加水量、糊化溫度及糊化時間對藜麥糖化醪總黃酮及還原糖含量的影響 由圖1a可知,在加水量300%～700%的范圍內,隨著水量的增加,總黃酮含量起初增長速率較快,之后緩慢增長,其原因是藜麥淀粉中80%以上是支鏈淀粉[25],支鏈淀粉的溶脹度高,吸水性強[26],加水量低時,大部分的水被淀粉分子吸收結合,醪液粘稠,黃酮物質溶出少;加水量增大,黃酮等物質快速逸出,在達到最大持水量后黃酮含量的增長速度趨于平緩;加水量過多會使糖化醪中的還原糖濃度較低,不利于進一步發(fā)酵。在加水量為500%時,糖化醪的還原糖含量足夠供給微生物代謝發(fā)酵,總黃酮含量也處于較高水平,可以保證藜麥發(fā)酵產品的產量及質量。

圖1 加水量、糊化溫度及糊化時間對藜麥糖化醪總黃酮及還原糖含量的影響Fig.1 Effects of amount of water addition,gelatinizationtemperature and gelatinization time on total flavonoidsand reducing sugar content in quinoa mash

由圖1b可知,藜麥糖化醪的總黃酮含量在60～80 ℃之間隨著溫度的升高而有所提高,但當溫度高于80 ℃,其含量逐漸下降。在60 ℃時藜麥黃酮含量處于較低水平,可能是黃酮在蘆丁降解酶的作用下發(fā)生部分分解[27-28];同時,溫度較低會使藜麥顆粒吸水溶脹但不破裂,還原糖含量也處于較低水平。隨著溫度的升高,蘆丁降解酶基本失活,藜麥熟化后顆粒漲破,分子運動加快,總黃酮含量表現(xiàn)為緩慢增加的趨勢,但在糊化溫度高于80 ℃時,黃酮含量有所下降,90 ℃時下降趨勢明顯,原因可能是黃酮在較高溫度下發(fā)生的氧化作用所致,同時多數(shù)維生素會被破壞[29]。還原糖含量則在60～90 ℃之間快速增加,藜麥的易熟化與其支鏈淀粉含量高有關,研究表明藜麥在70 ℃條件下即可開始糊化[30];但是在溫度高于90 ℃的條件下糊化時,藜麥籽實外圍的淀粉先被糊化后體積膨脹,一定程度上抑制了內部淀粉繼續(xù)糊化,表現(xiàn)為還原糖含量增長較緩,故本實驗在考慮保留更多功能成分、減少能耗的條件下選擇糊化溫度為80 ℃進行下一步試驗。

由圖1c可知,隨著糊化時間的延長,藜麥總黃酮含量緩慢降低,可能與較長時間的水解與氧化有關。還原糖含量先在30～40 min之間快速增加,40 min之后緩慢增加,可能的原因是淀粉的轉化率有限,在一定時間內淀粉分解成糖的速率較快,隨著時間的增加轉化率會有所降低[31];綜合考慮,選擇糊化時間為40 min繼續(xù)下一步試驗。

2.1.2 液化酶添加量、液化溫度及時間對總黃酮及還原糖含量的影響 由圖2a可知隨著α-淀粉酶添加量的增大,藜麥糖化醪的還原糖含量明顯升高,但是總黃酮含量卻顯著降低,可能是α-淀粉酶對黃酮類有一定的降解作用,Schneider等[32]和Braune等[33]發(fā)現(xiàn)人體腸道內的α-D-葡糖苷酶及β-D-葡糖苷酶酶對黃酮類化合物有降解作用,而α-淀粉酶對黃酮的破壞作用應與之相關。從單因素試驗的結果來看,還原糖含量與α-淀粉酶的添加量有較大相關性,當α-淀粉酶添加量為800 U/g時,糖化醪中還原糖含量為11.6 g/100 mL,能夠滿足發(fā)酵所需的含糖要求；且總黃酮含量為147.6 mg/100 mL,仍處于較高水平，故本實驗選擇淀粉酶添加量為800 U/g做進一步試驗。

圖2 α-淀粉酶添加量、液化溫度及液化時間對藜麥糖化醪總黃酮及還原糖含量的影響Fig.2 Amount of α-amylase addition,liquefactiontemperature and liquefaction time on totalflavonoids and reducing sugar content in quinoa mash

由圖2b可知α-淀粉酶對溫度較為敏感,其最適溫度為80～90 ℃,低于最適溫度α-淀粉酶的活力低,而溫度過高又會使其部分失活;還原糖含量受到α-淀粉酶活力的影響,在80 ℃時有峰值出現(xiàn);而黃酮類在液化溫度的變化過程中,受到α-淀粉酶活力及溫度的共同影響,當溫度處于80 ℃時,總黃酮含量處于低谷;溫度大于80 ℃時,由于高溫使α-淀粉酶失活,總黃酮含量有所回升,但是在高溫度下總黃酮亦會氧化分解。但是由圖2b可知,總黃酮含量的整體波動較小,故本實驗選擇液化溫度為80 ℃進行下一步試驗。

由圖2c可知,液化時間對總黃酮含量的影響很大,作用機理可能是在適宜的溫度下α-淀粉酶對黃酮較長時間的酶解使之遭到破壞,而且隨著作用時間的延長破壞程度增大;還原糖含量則隨著液化時間的延長持續(xù)增加,但還原糖含量的增加不足以彌補總黃酮量的損失,故液化時間不宜過長。本實驗選擇液化時間為20 min進行下一步試驗。

2.1.3 糖化酶添加量、糖化溫度及時間對藜麥糖化醪總黃酮及還原糖含量的影響 由圖3a可知,在糖化酶添加量為1000～4000 U/g的范圍內,隨著糖化酶添加量的增加,還原糖含量快速增加;之后緩慢增加,原因是糖化酶能很快水解藜麥直鏈淀粉的α-1,4糖苷鍵,使得還原糖含量快速升高,但是糖化酶對支鏈淀粉的分解速度較慢[34],表現(xiàn)為糖化醪的還原糖含量增加趨于平緩;而總黃酮的下降趨勢可能是因為糖化酶將藜麥總黃酮中的少部分類黃酮水解為異黃酮糖苷[35],異黃酮糖苷亦能發(fā)揮生理功能[36]。但是糖化酶對藜麥黃酮是否具有其他的破壞作用還不能確定,因此,綜合考慮選擇糖化酶的添加量為4000 U/g進行下一步試驗。

圖3 糖化酶添加量、糖化溫度及糖化時間對藜麥糖化醪總黃酮及還原糖含量的影響Fig.3 Amount of glucoamylase addition,saccharificationtemperature and saccharification time on totalflavonoids and reducing sugar content in quinoa mash

由圖3b可知,糖化酶的最適溫度為65 ℃,在該點還原糖含量接近峰值,在選擇糖化溫度時,考慮到糖化溫度對于總黃酮含量的影響較小,總體波動不超過10 mg/100 mL,故選擇糖化溫度為65 ℃繼續(xù)下一步試驗。

由圖3c可知隨著糖化時間的延長,還原糖含量先快速增加后趨于平緩,而總黃酮含量則持續(xù)降低,原因與α-淀粉酶處理的原因類似,與糖化酶的活力及氧化作用有關。在糖化時間為50 min時,藜麥糖化醪還原糖含量接近最大值,同時總黃酮含量還處于較高水平。故選擇糖化時間為50 min進行下一步試驗。

2.2 Plackett-Burman試驗確定關鍵影響因素

2.2.1 Plackett-Burman試驗結果 在單因素試驗的基礎上,進行Plackett-Burman試驗,試驗設計及響應值見表4。

表4 Plackett-Burman試驗方案及結果Table 4 Experimental design and results of Plackett-Burman

由表4可知,分別以還原糖量、總黃酮為響應值建立回歸模型顯著?；貧w方程為:總黃酮含量=182.25-5.42A-0.58B-1.42C-2.58D-0.92E-3.42F+0.75G+0.083H-2.75I;還原糖含量=10.53-0.749A-0.075B+8.33C+0.13D-0.075E+0.48F-0.13G-0.042H+0.34I;兩個模型的決定系數(shù)R2分別為0.9941和0.9981,表明回歸有效,試驗設計可靠。由表5可知,加水量對還原糖及總黃酮含量影響極顯著;液化時間、糖化時間對還原糖含量影響極顯著,對總黃酮含量影響顯著;α-淀粉酶添加量則對總黃酮含量有顯著影響;故Plackett-Burman試驗篩選出的主要影響因素為加水量(X1)、α-淀粉酶添加量(X2)、液化時間(X3)和糖化時間(X4)。

表5 Plackett-Burman試驗各因數(shù)水平顯著性分析Table 5 Significance analysis of different factorsin the Plackett-Burman experiment

2.2.2 Box-Behnken響應面試驗結果 以加水量、α-淀粉酶添加量、液化時間和糖化時間為變量,藜麥糖化醪的總黃酮含量及還原糖含量的綜合評分為指標。采用Box-Behnken響應曲面法(BBD)進行四因素三水平的組合試驗,結果見表6。

表6 Box-Behnken試驗設計方案及響應值Table 6 Experimental design and results of Box-Behnken

表7 回歸系數(shù)及顯著性分析Table 7 Regression coefficients and significance analysis

2.2.3 藜麥糖化工藝條件的確定 單因素試驗的研究結果為糊化溫度為80 ℃、糊化時間為40 min、液化溫度為80 ℃、糖化酶添加量為4000 U/g、糖化溫度為65 ℃,結合以藜麥糖化醪的綜合評分為響應值的響應面優(yōu)化結果:加水量496.73%、α-淀粉酶添加量800 U/g、液化時間17.72 min、糖化時間49.32 min,進行驗證試驗,在此條件下的驗證結果為藜麥糖化醪的還原糖含量12.3 g/100 mL、總黃酮含量182 mg/100 mL,綜合評分為88分。結合實際生產需要,將工藝調整為加水量500%、糊化溫度80 ℃、液化酶添加量800 U/g、液化時間17 min、液化溫度80 ℃、糖化酶添加量4000 U/g、糖化溫度65 ℃、糖化時間50 min,此條件下得到的藜麥糖化醪還原糖含量為11.8 g/100 mL、總黃酮含量為185 mg/100 mL、綜合評分為86.5分。

圖4 各因素交互作用對藜麥糖化醪綜合評分影響的響應面圖Fig.4 Response surface graphs showing the interactive effect of different factorson comprehensive score of quinoa mash

3 結論

該試驗在保證藜麥糖化醪具有良好發(fā)酵性能的前提下,盡可能多的保留了藜麥中的功能成分黃酮類物質。在單因素試驗及Plackett-Burman試驗的基礎上,篩選出加水量、α-淀粉酶添加量、液化時間及糖化時間這4個顯著影響因素,采用響應面分析法優(yōu)化了藜麥糖化工藝,最優(yōu)條件為加水量500%、糊化溫度80 ℃、液化酶添加量800 U/g、液化時間17 min、液化溫度80 ℃、糖化酶添加量4000 U/g、糖化溫度65 ℃、糖化時間50 min。在此條件下,得到的藜麥糖化醪還原糖含量為11.8 g/100 mL、總黃酮含量為185 mg/100 mL、綜合評分為86.5分。

將含有更多功能成分的藜麥糖化醪應用于發(fā)酵行業(yè),可以提高產品的營養(yǎng)價值,實現(xiàn)藜麥資源的高值化利用,同時能為其他功能谷物發(fā)酵產品的糖化工藝提出參考意見,具有一定的理論意義及應用價值。