張魯寧,宋元達(dá),張懷淵,*

(1.山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院,山東淄博 255000; 2.上海科技管理干部學(xué)院,上海 201800)

耶氏解脂酵母(Yarrowialipolytica)是一種產(chǎn)油產(chǎn)酸酵母,于1942年被首次分離得到[1]。在一定條件下,耶氏解脂酵母能將碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭忍荚崔D(zhuǎn)化為微生物油脂(microbial oil),可用于合成生物柴油(biodiesel),緩解日益嚴(yán)重的環(huán)境問題和能源安全問題。經(jīng)基因工程改造的耶氏解脂酵母也可生產(chǎn)功能性脂肪酸,如α-亞麻酸[2]、二十碳五烯酸(EPA)[3]、共軛亞油酸(CLA)[4]等。此外,耶氏解脂酵母能夠利用糖類、乙醇和醋酸等發(fā)酵產(chǎn)生并大量分泌檸檬酸(citric acids)[5]。檸檬酸在食品飲料與藥品兩大領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,全球檸檬酸需求穩(wěn)增,亞太地區(qū)尤其是中國檸檬酸市場增長率高。近年來耶氏解脂酵母已被考慮作為檸檬酸生產(chǎn)的潛在菌種而成為研究的熱點[6-8]。

微生物油脂合成和檸檬酸分泌有著相近的代謝途徑(圖1)[9-11]。大量研究表明,耶氏解脂酵母油脂合成和檸檬酸積累之間的代謝轉(zhuǎn)化與營養(yǎng)限制培養(yǎng)基(如氮、磷、鎂)或培養(yǎng)條件(如生長情況、含氧量、pH或溫度)有關(guān)[7]。在細(xì)胞內(nèi)氮源缺乏時,腺苷一磷酸(AMP)濃度下降,TCA循環(huán)途徑中的異檸檬酸脫氫酶活性受到抑制,導(dǎo)致上游的異檸檬酸和檸檬酸大量積累,線粒體內(nèi)積累的大量檸檬酸經(jīng)過線粒體膜上檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(mitochondrial citrate transporter,mCT)被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中,這個過程是油脂合成和檸檬酸分泌兩者共有的。隨后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的檸檬酸有兩條代謝路徑,一條是檸檬酸被ATP檸檬酸裂解酶(ATP citrate lyase,ACL)裂解生成乙酰輔酶A用于脂肪酸合成。另一條是檸檬酸被細(xì)胞膜上檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(cytoplasmic citrate transporter,cCT)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外。由此可見,檸檬酸是糖酵解與油脂合成的重要連接物,檸檬酸在整個油脂積累過程中占據(jù)著重要地位。

圖1 酵母油脂合成和檸檬酸分泌的代謝途徑[7,9-11]Fig.1 Metabolism pathway of oil synthesisand organic acid secretion in yeast[7,9-11]注:mCT:mitochondrial citrate transporter,線粒體膜上檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;cCT:cytoplasmiccitrate transporter,細(xì)胞膜上檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

重金屬離子會影響微生物產(chǎn)油產(chǎn)酸。過量重金屬離子Cu2+和Cd2+能抑制Aspergillusniger的生長和檸檬酸分泌[12]。而Mn2+、Mg2+、Fe2+和Zn2+則能促進(jìn)Aspergillusniger檸檬酸分泌[13-14]。為了探究重金屬離子對耶氏解脂酵母產(chǎn)油產(chǎn)酸的影響,本研究選取了11種重金屬離子,通過測定生物量、細(xì)胞外檸檬酸含量、油脂含量及脂肪酸組成等指標(biāo),從中篩選出對耶氏解脂酵母產(chǎn)油產(chǎn)酸影響相對顯著的重金屬離子,并進(jìn)一步研究了不同濃度梯度下的此類重金屬離子對耶氏解脂酵母油脂含量和檸檬酸分泌的影響。為進(jìn)一步探究產(chǎn)油微生物油脂積累和檸檬酸分泌兩者代謝路徑間的生化關(guān)系打下鋪墊,為今后尋求微生物油脂及檸檬酸的工業(yè)生產(chǎn)提供理論幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

耶氏解脂酵母YarrowialipolyticaCICC1778(ATCC 20460) 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;葡萄糖、ZnCl2、CaCl2、CuCl2、CoCl2·6H2O、CrCl3·6H2O、NiCl2、MnCl2、MgCl2·6H2O、FeCl2·4H2O、FeCl3、AlCl3、NaCl、HCl、硫酸銨、丙三醇、甲醇、三氯甲烷 均為分析純,國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司;正己烷(色譜純) 國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司;酵母提取物、胰蛋白胨 Oxoid公司;無氨基酵母氮源(Yeast Nitrogen Base Without Amino acids,YNB) 生工工程(上海)股份有限公司;脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司。

SW-CJ-1FD型超凈工作臺 上海智誠儀器廠;MLS-3750型滅菌鍋 SANYO Electric Co.,Ltd;ZHWY-2102型回轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床 上海智城分析儀器制造有限公司;EL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;PB3002-N型分析電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;4K15型高速冷凍離心機(jī) 上海博鑫儀器有限公司;DK-8D型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司;Thermo707型超低溫冰箱 REVCO;QSC-12T 型氮吹儀 上海泉島公司;GC 2010 型氣相色譜儀 日本島津制造所;Agilent 1100高效液相色譜儀 美國Agilent Technologies公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

1.2.1.1 種子培養(yǎng)基 葡萄糖20 g/L,酵母提取物10 g/L,蛋白胨20 g/L。分裝成50 mL/瓶,115 ℃滅菌20 min。

1.2.1.2 產(chǎn)脂產(chǎn)酸培養(yǎng)基 甘油100 g/L,YNB 1.7 g/L,(NH4)2SO41.0 g/L。分裝成50 mL/瓶,115 ℃滅菌20 min。

1.2.2 重金屬離子溶液配制 根據(jù)金屬離子氯化物的溶解度,分別稱取適量的ZnCl2、CaCl2、CuCl2、CoCl2、CrCl3固體配制成0.5 mol/L的水溶液;分別稱取適量的NiCl2、MnCl2固體配制成1.0 mol/L的水溶液;稱取適量的MgCl2固體配制成0.3 mol/L的水溶液,115 ℃滅菌20 min。分別稱取適量FeCl2、FeCl3、AlCl3固體配制成0.5 mol/L的水溶液,過濾滅菌。

1.2.3 菌種培養(yǎng) 從保菌管中取100 μL含有30%(w/V)甘油的菌液,加入種子培養(yǎng)基,在28 ℃ 200 r/min搖床中培養(yǎng)24 h;收集1 mL菌液于1.5 mL離心管中,于5000 r/min下離心5 min,棄上清,超凈臺內(nèi)取少量產(chǎn)脂產(chǎn)酸培養(yǎng)基吹吸菌體沉淀,使其再次懸浮,然后轉(zhuǎn)移至產(chǎn)脂產(chǎn)酸培養(yǎng)基內(nèi),在28 ℃ 200 r/min搖床中培養(yǎng)80 h。

1.2.4 重金屬離子類型對耶氏解脂酵母的影響 在產(chǎn)脂產(chǎn)酸培養(yǎng)基(50 mL)中,分別加入終濃度為2 mmol/L的Zn2+、Ni2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Co2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Al3+、Cr3+11種重金屬離子,發(fā)酵培養(yǎng)80 h,以無重金屬離子添加的空白組為對照組,測定生物量、檸檬酸含量、油脂含量及脂肪酸組成等指標(biāo),篩選出對耶氏解脂酵母油脂含量和檸檬酸分泌量有影響的重金屬離子。

1.2.5 不同濃度梯度的重金屬離子對耶氏解脂酵母的影響 將篩選出的Mn2+、Co2+、Cu2+、Ni2+4種重金屬離子分別設(shè)置成不同的濃度梯度:Mn2+:0(對照)、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L;Co2+:0(對照)、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L;Cu2+和Ni2+:0(對照)、0.25、0.50、0.75和1.00 mmol/L。發(fā)酵培養(yǎng)80 h,測定生物量、檸檬酸含量、油脂含量及脂肪酸組成等指標(biāo),探究不同濃度梯度的重金屬離子對耶氏解脂酵母的影響。

1.2.6 菌體收集及生物量測定 菌體收集及生物量測定參照林義等[15]方法。量取4 mL培養(yǎng)80 h后的菌液于5 mL離心管(事先烘干稱重m1,g)中,在4000 r/min下,離心3 min,棄上清,用4 mL去離子水洗滌沉淀,在4000 r/min下離心3 min,棄去上清,沉淀冷凍干燥后稱重m2(g)。

生物量(g/L)=(m2-m1)×250

式(1)

1.2.7 脂質(zhì)提取及脂肪酸甲酯化 脂質(zhì)提取及脂肪酸甲酯化參照Papanikolaou等[16]方法。量取2 mL培養(yǎng)80 h后的菌液于提脂瓶中,在4000 r/min下離心3 min,棄去上清,用4 mL去離子水洗滌沉淀,在4000 r/min下離心3 min,棄去上清,沉淀用于提取脂質(zhì)。

1.2.7.1 脂質(zhì)提取 加入2 mL 4 mol/L的HCl溶液,80 ℃水浴3 h。水浴結(jié)束后,冷卻至室溫,加入1 mL甲醇、2 mL氯仿和100 μL標(biāo)樣C15∶0,震蕩30 min,在3000 r/min下離心3 min,下層液體移至新玻璃瓶,氮氣吹干。

1.2.7.2 甲酯化 氮吹后加入1 mL 10%鹽酸-甲醇溶液,60 ℃水浴3 h。水浴結(jié)束后加入1 mL飽和NaCl溶液、2 mL正己烷,在3000 r/min條件下離心3 min,取1 mL上層清液移入氣相瓶。

1.2.8 脂肪酸含量測定 肪酸含量測定參照陳海元等[17]方法。使用氣相色譜儀對樣品進(jìn)行檢測,氣相色譜柱為 DB-WAX column(30 m×0.32 mm,0.22 μm),氫離子火焰(FID)檢測器,載氣為氫氣,流量為40 L/min,檢測條件為:檢測器溫度為260 ℃,進(jìn)樣口溫度為240 ℃,進(jìn)樣量為1 μL,分流比15.4∶1,柱升溫程序為120 ℃保持3 min,以5 ℃/min的速率升溫至190 ℃,再以4 ℃/min的速率升溫至220 ℃,保持2 min。使用內(nèi)標(biāo)法(C15∶0)根據(jù)氣相圖中色譜峰的出峰時間和峰面積進(jìn)行脂肪酸分析。

油脂含量(%)=油脂質(zhì)量(W1,mg)/細(xì)胞干重(W2,mg)×100

式(2)

1.2.9 檸檬酸含量測定 檸檬酸含量測定參照Papanikolaou等[16]方法。量取1.5 mL培養(yǎng)80 h后的菌液于離心管中,在12000 r/min下離心5 min,取1 mL上層清液移入液相瓶。使用高效液相色譜儀對樣品進(jìn)行檢測,色譜柱為:Ecosil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為:甲醇/水/磷酸=5∶95∶0.05,流速為0～8 mL/min,柱溫為30 ℃,檢測器為UV-210 nm,進(jìn)樣量為10 μL。以已知濃度的檸檬酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品作為參比,計算各樣品的檸檬酸的濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗3個重復(fù),結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計軟件(V16.0)進(jìn)行統(tǒng)計分析,多組數(shù)據(jù)比較時,采用ANOVA進(jìn)行Duncan’s多重比較進(jìn)行差異分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬離子類型對耶氏解脂酵母產(chǎn)脂產(chǎn)酸的影響

在重金屬離子終濃度為2 mmol/L的環(huán)境中,探索并鑒定了Zn2+、Ni2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Co2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Al3+、Cr3+11種重金屬離子對耶氏解脂酵母油脂積累量和檸檬酸分泌量的影響(表1)。Cu2+和Ni2+明顯抑制其生物量,與對照組相比,生物量分別下降了86%和73%。Mn2+促進(jìn)檸檬酸分泌,相比于對照組檸檬酸分泌量增加了83%;Cu2+、Ni2+、Cr3+和Fe3+則抑制檸檬酸分泌,與對照組相比,檸檬酸分泌量分別下降了95%、81%、80%和76%。Cu2+、Ni2+明顯抑制其油脂積累,相比于對照組油脂含量分別下降了81%和65%。不同類型重金屬離子影響耶氏解脂酵母脂肪酸組成見表2，Cu2+和Ni2+使C18∶2的組成比明顯增多,C18∶0的組成比大幅減少;Co2+明顯降低了C18∶1的組成比,Cr3+增加了C18∶1的組成比;Fe2+降低了C18∶0的組成比。

表1 重金屬離子對耶氏解脂酵母的生物量、檸檬酸分泌量和油脂含量的影響Table 1 Effect of heavy metal ions on biomass,citric acidsecretion and lipid contents in Yarrowia lipolytica

綜上分析,Cu2+、Ni2+對生長有明顯的抑制作用,也嚴(yán)重影響了檸檬酸分泌量和油脂積累量;同時也促進(jìn)了脂肪酸不飽和度的增加;Co2+增加了飽和脂肪酸的組成比;Mn2+對檸檬酸分泌有明顯的促進(jìn)作用。

2.2 不同濃度梯度的Mn2+、Co2+、Cu2+、Ni2+對耶氏解脂酵母產(chǎn)脂產(chǎn)酸的影響

2.2.1 Mn2+對耶氏解脂酵母油脂積累量及檸檬酸分泌量的影響

如圖2所示,不同濃度的Mn2+對耶氏解脂酵母生物量沒有顯著影響(各實驗組生物量約10 g/L);對油脂積累量有一定的促進(jìn)作用,但未表現(xiàn)出明顯的濃度梯度效應(yīng),Mn2+在1.0和2.5 mmol/L時,油脂含量分別達(dá)到峰值(17.6%和17.2%);Mn2+對檸檬酸分泌的促進(jìn)作用與濃度梯度有一定的規(guī)律,隨著Mn2+濃度升高,檸檬酸分泌量呈現(xiàn)先增加后減少趨勢,在2.0 mmol/L左右,檸檬酸的分泌量達(dá)到最大值(6.9 g/L)。不同濃度的Mn2+對耶氏解脂酵母脂肪酸組成無明顯影響,各濃度梯度之間的脂肪酸組成比無規(guī)律(表3)。

表3 不同濃度Mn2+對耶氏解脂酵母脂肪酸組成的影響Table 3 Effect of different concentrations of Mn2+ on fatty acid profile in Yarrowia lipolytica

圖2 不同濃度Mn2+對耶氏解脂酵母生物量、油脂含量及檸檬酸分泌的影響Fig.2 Effect of different concentrations of Mn2+ on biomass,lipid contents and citric acid secretion in Yarrowia lipolytica注:不同小寫字母表示同一指標(biāo)不同濃度之間差異顯著,P<0.05;圖2～圖5同。

綜上分析,Mn2+對耶氏解脂酵母的生長情況及脂肪酸組成無明顯影響,但適宜濃度下會促進(jìn)油脂積累與檸檬酸分泌。

2.2.2 Co2+對耶氏解脂酵母油脂積累量及檸檬酸分泌量的影響 如圖3所示,相比于對照組,Co2+的添加會抑制耶氏解脂酵母的生長,但與濃度梯度之間未呈現(xiàn)明顯關(guān)系。低濃度Co2+(0.5 mmol/L)對油脂積累和檸檬酸分泌有一定的促進(jìn)作用;隨著Co2+濃度增加,油脂含量與濃度梯度之間無明顯規(guī)律,但檸檬酸分泌量隨濃度增加而減少,在2.0 mmol/L時檸檬酸分泌量相比于對照組抑制了43%。表4中Co2+明顯增加了C18∶0組成比,明顯減少了C16∶1、C18∶1組成比,但與濃度梯度之間無規(guī)律。Co2+是否通過抑制Δ9-脂肪酸去飽和酶阻礙Δ9位上雙鍵的形成而降低C16∶1、C18∶1組成比有待研究。

圖3 不同濃度Co2+對耶氏解脂酵母生物量、油脂含量及檸檬酸分泌的影響Fig.3 Effect of different concentrations of Co2+ on biomass,lipid contents and citric acid secretion in Yarrowia lipolytica

表4 不同濃度Co2+對耶氏解脂酵母脂肪酸組成的影響Table 4 Effect of different concentrations of Co2+ on fatty acid profile in Yarrowia lipolytica

綜合分析,Co2+抑制耶氏解脂酵母的生長,低濃度Co2+(0.5 mmol/L)對油脂積累及檸檬酸分泌有一定的促進(jìn)作用,高濃度條件下(≥1.0 mmol/L)對檸檬酸分泌有明顯的抑制效果;Co2+的添加促使飽和脂肪酸含量上升,單不飽和脂肪酸含量下降。

2.2.3 Cu2+對耶氏解脂酵母油脂積累量及檸檬酸分泌量的影響 Cu2+對生物量、檸檬酸和油脂含量均有不同程度的抑制,而高濃度的Cu2+(>1.0 mmol/L)能夠完全抑制酵母細(xì)胞檸檬酸的分泌,而低濃度的Cu2+(≤0.5 mmol/L)對油脂含量和檸檬酸分泌無明顯的抑制,但高濃度的Cu2+(1.0 mmol/L)則表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用,其油脂積累量相比于對照組下降了94%,已基本抑制了耶氏解脂酵母的油脂積累;同時檸檬酸分泌也幾乎被完全抑制(圖4)。即在耶氏解脂酵母中,過量的Cu2+既抑制了檸檬酸的分泌,也影響了油脂積累。研究表明,過量金屬離子Cu2+雖然抑制了Aspergillusniger的生長和檸檬酸分泌,但是細(xì)胞中脂質(zhì)和多糖含量大大增加[12]。兩者不同表現(xiàn)對應(yīng)的機(jī)理有待解析。Cu2+降低了C18∶0組成比,增加了C18∶2組成比。隨著Cu2+濃度的增加,C18∶0組成比明顯降低,C18∶2組成比大幅增加。同時,高濃度的Cu2+(≥0.75 mmol/L)也使得C18∶1組成比大幅減少。當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到1.0 mmol/L,C18∶2組成比相比于對照組增加了近4.6倍(表5)。高濃度Cu2+是否可以促進(jìn)C18∶0、C18∶1向C18∶2的轉(zhuǎn)化及其機(jī)制有待探究。

圖4 不同濃度Cu2+對耶氏解脂酵母生物量、油脂含量及檸檬酸分泌的影響Fig.4 Effect of different concentrations of Cu2+ on biomass,lipid contents and citric acid secretion in Yarrowia lipolytica

表5 不同濃度Cu2+對耶氏解脂酵母脂肪酸組成的影響Table 5 Effect of different concentrations of Cu2+ on fatty acid profile in Yarrowia lipolytica

綜合分析,Cu2+對耶氏解脂酵母的生長情況具有明顯抑制作用,低濃度條件下對油脂積累及檸檬酸分泌的影響不明顯,高濃度對兩者均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

2.2.4 Ni2+對耶氏解脂酵母油脂積累量及檸檬酸分泌量的影響 如圖5,Ni2+對耶氏解脂酵母生長的抑制作用不明顯。油脂含量雖受到Ni2+的抑制,但是與濃度無明顯相關(guān)性。檸檬酸分泌量隨著Ni2+濃度增加表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,在0.5 mmol/L時檸檬酸分泌量達(dá)到最大值(5.2 g/L),相比對照組增加了37%。隨著Ni2+濃度升高,C16∶0、C18∶0組成比明顯降低,C18∶1組成比有所增加。當(dāng)Ni2+濃度為1.0 mmol/L時,相比對照組,C16∶0組成比下降了42%,C18∶1組成比增加了21%(表6)。

表6 不同濃度Ni2+對耶氏解脂酵母脂肪酸組成的影響Table 6 Effect on fatty acid profile in Yarrowia lipolytica under different concentrations of Ni2+

圖5 不同濃度Ni2+對耶氏解脂酵母生物量產(chǎn)脂量及檸檬酸分泌的影響Fig.5 Effect on biomass,lipid contents and citric acid secretionin Yarrowia lipolytica under different concentrations of Ni2+

綜合分析,Ni2+對耶氏解脂酵母的生長和油脂積累量有一定的抑制作用,與濃度梯度無明顯相關(guān)性;檸檬酸分泌量與濃度梯度有一定的相關(guān)性,隨濃度增加表現(xiàn)為先增加后減少的趨勢,在0.5 mmol/L檸檬酸分泌量達(dá)到最大值(5.2 g/L)。

3 討論與結(jié)論

產(chǎn)油產(chǎn)酸微生物是獲取微生物油脂和檸檬酸等有機(jī)酸的重要來源,在食品藥品中具有廣泛應(yīng)用價值[18-21]。認(rèn)識和調(diào)控微生物油脂合成和檸檬酸分泌代謝途徑,具有重要的理論與現(xiàn)實價值。檸檬酸是糖酵解與油脂合成的重要連接物。檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)時會特異性的選擇金屬離子先形成檸檬酸鹽絡(luò)合物,后通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。Streptococcus突變菌株的檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)依托Fe3+進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn),檸檬酸先與Fe3+形成檸檬酸鹽,后依托轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)[22];E.faecalis轉(zhuǎn)運(yùn)檸檬酸則依托Ca2+、Sr2+、Mn2+、Cd2+和Pb2+[14]。耶氏解脂酵母檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白特異性選擇何種重金屬離子優(yōu)先絡(luò)合有待驗證。此外,過量金屬離子Cu2+對Aspergillusniger和Yarrowialipolytica生長、檸檬酸分泌量和油脂積累量影響的不同表現(xiàn)對應(yīng)的機(jī)理有待解析。Co2+是否通過抑制Δ9-脂肪酸去飽和酶阻礙Δ9位上雙鍵的形成而降低C16∶1和C18∶1組成比、高濃度Cu2+是否可以促進(jìn)C18∶0和C18∶1向C18∶2的轉(zhuǎn)化及其機(jī)制等仍有待探究。