肖默艷,黃燕芬,王東偉,趙 雷,王 凱,胡卓炎

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

火龍果(HylocereusundatusBritt)又稱紅龍果、仙蜜果,是仙人掌科(Cactaceae)量天尺屬(Hylocereusundatus)和蛇鞭柱屬(Seleniereusmejalantous)植物,按果皮果肉顏色主要分為紅皮白肉、紅皮紅肉、黃皮白肉3大類[1]。紅皮紅肉火龍果果實中富含甜菜紅素,還含有多酚和黃酮等天然活性成分,近年來逐漸受到人們的關(guān)注。

研究表明甜菜紅素、多酚和黃酮這三類物質(zhì)均能清除自由基及減少自由基的形成,其結(jié)構(gòu)、含量與生物活性具有良好的相關(guān)性[2-5],而不同植物中這三類物質(zhì)存在極大差異。目前諸多關(guān)于火龍果色素提取物抗氧化活性的研究,鮮有探討提取物中存在與甜菜紅素結(jié)構(gòu)及性質(zhì)相似的多酚和黃酮類物質(zhì)的作用。甜菜紅素的化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗氧化活性關(guān)系密切,但火龍果中主要色素Betanin和Phyllocactin的活性差異尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅肉火龍果(HylocereusundatusBritt) 均為食用成熟期的市售水果,具體產(chǎn)地及品種見表1;ABTS(2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽) 分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼自由基) 分析純,梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;三吡啶三吖嗪 分析純,上海麥克林生化科技有限公司;甲醇 色譜純,默克試劑公司;甲酸 色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

表1 紅肉火龍果的產(chǎn)地及品種Table 1 Origins and varieties of red dragon fruit

ME104E分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TD5-Ⅱ低速離心機 長沙平凡儀器儀表公司;UVmini-1240紫外分光光度計、LC-20AT高效液相色譜儀(配紫外檢測器)、Uplc1290-6540B Q-TOF液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司;Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 紅肉火龍果剝皮果肉打漿混勻,稱取40.0 g果漿,按料液比1∶4 (g/mL)加入40%乙醇溶液[6],在提取溫度30 ℃、超聲波功率100 W條件下提取20 min,在3500 r/min下離心15 min,取上清液,4 ℃冷藏備用。

1.2.2 甜菜紅素含量測定 參考Herbach等[7]的方法。取1 mL提取液于100 mL容量瓶中,蒸餾水定容至刻度,搖勻,分別在波長537、600 nm處,以蒸餾水為空白,測定其在兩波長處的吸光度。

式中:A為537 nm所測定的吸光度減去600 nm所測定的吸光度;Mw為甜菜苷的相對分子質(zhì)量(Mw=550 g/mol);DF為稀釋倍數(shù);ε為甜菜紅素的摩爾吸收率(ε=60000 L/(mol·cm));l為比色皿的厚度。

1.2.3 總酚含量測定 采用Folin-Ciocalteu法測定提取液的總酚含量[8],配制0～1000 mg/L的沒食子酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別取0.1 mL標(biāo)液于10 mL容量瓶內(nèi),加0.5 mL福林酚溶液,室溫下反應(yīng)3～4 min,加入1.5 mL的20%碳酸鈉溶液,以水定容至刻度混勻后室溫下反應(yīng)2 h,在765 nm處測定吸光值,以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),得標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0011x+0.0067,R2=0.998。取0.1 mL提取液按此方法測得吸光度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算提取液中總酚含量。由于該反應(yīng)試劑會氧化甜菜紅素的酚羥基,故此法測得的含量減去甜菜紅素含量,為除甜菜紅素外的總酚含量(mg/L)。

1.2.4 黃酮含量測定 總黃酮含量的測定參考Phongtongpasuk等[9]方法,稍作修改。配制0～40 mg/L蘆丁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別取1 mL標(biāo)液于10 mL容量瓶,加4 mL 30%乙醇溶液,混勻,加0.3 mL5%亞硝酸鈉溶液,混合后放置5 min,加0.3 mL10%的硝酸鋁溶液,混合后放置5 min,加入3 mL1 mol/L NaOH溶液,并用30%乙醇定容至刻度,反應(yīng)15 min后測定510 nm處的吸光值,以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),得標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=11.723x-0.0027,R2=0.9991。取1 mL提取液按此方法測得吸光度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算得樣品中總黃酮含量為每升提取液中蘆丁的含量(mg/L)。

1.2.5 體外抗氧化活性測定

1.2.5.1 總抗氧化能力的測定 參照Benzie等[10]的方法,FRAP工作液由10 mmol/L Fe3+-三吡啶三吖嗪溶液、20 mmol/L氯化鐵溶液以及0.3 mol/L,pH3.6的醋酸鹽緩沖液按1∶1∶10混合組成,配制0～1 mmol/L硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別取100 μL標(biāo)液于棕色試管中,加入3 mL的FRAP工作液,混勻,37 ℃下反應(yīng)10 min后于593 nm處測定吸光值,以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),得標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.6353x+0.0178,R2=0.9981。并將相應(yīng)的硫酸亞鐵濃度(mmol/L)定義為FRAP值,作為總抗氧化能力的活性單位(U)。取100 μL提取液按此方法測得吸光度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線進行計算,總抗氧化能力以每毫升提取液中含有的活性單位表示(U/mL)。

1.2.5.2 清除DPPH·能力的測定 參照張素芳等[11]的方法,取4 mg DPPH,以95%乙醇溶解后,定容至100 mL棕色容量瓶,制得DPPH反應(yīng)液。取1 mL 95%乙醇,加4 mL DPPH反應(yīng)液,避光反應(yīng)30 min,在517 nm波長處測定其吸光值,記為A0;分別取1 mL稀釋2～7倍后的提取液,加4 mL DPPH反應(yīng)液,反應(yīng)和測定方法同上,測得吸光值記為A1;分別取1 mL稀釋2～7倍后的提取液,加4 mL 95%乙醇溶液,反應(yīng)和測定方法同上,測得吸光值記為A2。根據(jù)以下公式計算DPPH·清除率:DPPH·清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0,以稀釋倍數(shù)和DPPH·清除率擬合線性方程,將對DPPH· 50%清除率定義為1個活性單位(U),清除DPPH·能力以每mL提取液中含有的活性單位來表示(U/mL)。

1.2.5.3 清除ABTS+·能力的測定 參照Huang等[12]的方法,ABTS+·反應(yīng)液由7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L過硫酸鉀水溶液等體積混合,4 ℃避光反應(yīng),靜置過夜后獲得。使用前用乙醇稀釋到吸光值在734 nm處為0.70±0.02。取1 mL 95%乙醇溶液,加4 mL的ABTS+·反應(yīng)液,避光反應(yīng)10 min后在734 nm波長處測定其吸光值,記為A0;分別取1 mL稀釋2～14倍后的提取液,加4 mL的ABTS+·反應(yīng)液,測定方法同上,測吸光值記為A1;再分別取1 mL稀釋2～14倍后的提取液,加4 mL的95%乙醇,測定方法同上,測吸光值記為A2。ABTS+·清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0,以稀釋倍數(shù)和ABTS+·清除率擬合線性方程,將對ABTS+· 50%清除率定義為1個活性單位(U),清除ABTS+·能力以每mL提取液中含有的活性單位來表示(U/mL)。

1.2.5.4 清除·OH能力的測定 參照黎海利等[13]的方法,5 mL反應(yīng)體系中含1 mL 10 mmol/L硫酸亞鐵溶液、2 mL 5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、1 mL 0.1%的H2O2溶液和1 mL稀釋1～2倍后的提取液,37 ℃反應(yīng)30 min,在510 nm 波長處測得吸光度A1;去離子水代替提取液測得A0;去離子水代替H2O2測得A2。·OH自由基清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0,以稀釋倍數(shù)和·OH清除率擬合線性方程,以·OH 50% 的清除率定義為1 個活性單位(U),清除·OH能力以每mL提取液中含有的活性單位來表示(U/mL)。

1.2.6 甜菜紅素成分分析及結(jié)構(gòu)鑒定 參考Faridah等[15]方法,稍作修改。采用高效液相色譜法,色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱;流動相A:0.4%甲酸-水溶液,流動相B:甲醇;梯度洗脫時間程序:0～5 min,10% B;5～30 min,10%～40% B;30～35 min,40%～90% B;35～40 min,90%～10% B;柱溫為30 ℃;流速為1 mL/min;進樣量為20 μL;檢測器為紫外檢測器,檢測波長為538 nm。

采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-MS)對各甜菜紅素組分進行鑒定[16]。液相條件如上所述,質(zhì)譜條件為ESI離子源,正離子掃描,掃描范圍m/z:105～1700,干燥氣體溫度300 ℃,干燥氣體流速9 L/min,碎裂電壓150 V。根據(jù)各甜菜紅素組分的質(zhì)譜碎片信息,對其進行初步鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗重復(fù)三次,采用IBM SPSS Statistics 20軟件對所有數(shù)據(jù)進行鄧肯氏單因素方差分析(P<0.05)、和Pearson相關(guān)性分析,運用SIMCA-P 11.5軟件進行偏最小二乘回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同火龍果果肉活性成分與抗氧化能力的單因素方差分析

不同品種和產(chǎn)地的紅心火龍果果肉提取液中活性成分含量及抗氧化能力存在差異,結(jié)果見表2。

表2 不同火龍果果肉的活性成分含量和抗氧化能力Table 2 Active ingredient content and antioxidant properties of different red dragon fruit

由表2結(jié)果可知,“海南金都1號”火龍果中甜菜紅素和黃酮含量最高,分別為76.77和9.00 mg/L,顯著高于其他“金都1號”和“蜜寶”品種的火龍果(P<0.05)。而“廣西大紅龍”火龍果中總酚含量最高,為53.01 mg/L,顯著高于除“廣西金都1號”外的其他樣品(P<0.05)?！皬V州蜜寶”提取液的活性成分含量均顯著高于“海南蜜寶”(P<0.05)。

2.2 不同火龍果果肉活性成分與抗氧化能力的相關(guān)性分析

表3 不同火龍果果肉活性成分和抗氧化能力之間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between active constituents and antioxidant capacities of different red dragon fruit

2.3 不同火龍果果肉中甜菜紅素成分分析及結(jié)構(gòu)鑒定

不同品種和產(chǎn)地火龍果果肉中甜菜紅素成分的HPLC分析,色譜圖如圖1所示。

圖1 不同品種和產(chǎn)地火龍果果肉中甜菜紅素組成的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatograms of betalaincompositions in dragon fruit from different varieties and origins注:1:betanin;2:isobetanin;3:phyllocactin;4:isophyllocactin。

利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》軟件(2004A)進行色譜峰的校正、匹配,確定4個共有峰。將圖中4個共有色譜峰作為特征峰,利用HPLC-MS進行結(jié)構(gòu)鑒定,檢測得一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖,結(jié)果如圖2。

如圖2(a)所示,特征峰1的保留時間為17.683 min組分的[M+H]+為551.1519,相對分子質(zhì)量550.1519,初步推斷為Betanindin-5-O-β-glucoside(Betanin)。二級質(zhì)譜中389.0979碎片是由Betanin脫去β-glucoside、150.0549是脫羧脫氧的甜菜醛氨酸,此兩個碎片信息進一步驗證了其為Betanin。如圖2(b)所示,特征峰2的保留時間為19.248 min組分的[M+H]+為551.1509,根據(jù)Stintzing等[17]的研究結(jié)果,推測是第一個組分的同分異構(gòu)體Isobetanindin-5-O-β-glucoside(Isobetanin)。二級質(zhì)譜碎片有389.0985、345.1071和150.0553,其中345.1071是由Isobetanin脫去β-glucoside和兩個羧基,進一步驗證推測。

如圖2(c)和(d),特征峰3和4的保留時間為22.736和23.738 min兩個組分的[M+H]+分別為637.1542和637.1515,根據(jù)Herbach等[18]研究結(jié)果,推測這兩個組分分別為Phyllocactin和Isophyllocactin。二級質(zhì)譜碎片均在593、389、278左右,其中593左右的碎片是由它們脫去羧基,389左右碎片是由它們脫去丙二?；挺?glucoside,278左右的碎片是丙二酰β-glucoside的結(jié)合物,由此驗證了推測的結(jié)論。

圖2 火龍果果肉中甜菜紅素一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖Fig.2 First-order mass spectrums and secondary mass spectrums of betalain in pitaya注:特征峰1(保留時間17.683 min)的一級質(zhì)譜圖(a1)和二級質(zhì)譜圖(a2);特征峰2(保留時間19.248 min)的一級質(zhì)譜圖(b1)和二級質(zhì)譜圖(b2);特征峰3(保留時間22.736 min)的一級質(zhì)譜圖(c1)和二級質(zhì)譜圖(c2);特征峰4(保留時間23.738 min)的一級質(zhì)譜圖(d1)和二級質(zhì)譜圖(d2)。

根據(jù)Herbach等對 Betanin和Phyllocactin描述的化學(xué)結(jié)構(gòu)式的分析[19],表明Isobetanin和Isophyllocactin分別是Betanin和Phyllocactin C-15位手性碳原子的反式結(jié)構(gòu)。

2.4 甜菜紅素的單體化合物含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

2.4.1 不同火龍果果肉中甜菜紅素單體化合物的單因素方差分析 以HPLC檢測不同火龍果提取液中甜菜紅素色譜圖的峰面積表示各物質(zhì)的相對含量,結(jié)果見表4。不同火龍果樣品中總甜菜紅素含量以及四種組分物質(zhì)含量均呈顯著性差異(P<0.05),Betanin、Isobetanin、Phyllocactin以及Isophyllocactin均在“廣西大紅龍”中含量最高,但“廣西桂紅龍1號”中所含的Isobetanin及Isophyllocactin與“廣西大紅龍”中含量無顯著性差異(P>0.05)。

表4 不同火龍果果肉中甜菜紅素組成及相對含量Table 4 Composition and relative content of betalain in different pitaya

甜菜紅素的化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗氧化活性關(guān)系密切,其基本結(jié)構(gòu)包含一個葡糖苷化的酚羥基和環(huán)胺基團,是良好的電子供體,具有較強的抗氧化活性[20],且隨著羥基或亞胺基數(shù)量的增加抗氧化活性增強[21],其中鄰苯二酚是重要的活性基團[22]。但尚未報導(dǎo)酰基化后的Phyllocactin和Betanin之間抗氧化活性強弱,為避免通過各種活性物質(zhì)精確分離后進行抗氧化效果對比研究的復(fù)雜繁瑣過程,采用偏最小二乘回歸法進行分析。

2.4.3 變量投影重要性分析 偏最小二乘回歸分析的結(jié)果由自變量的標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)和變量投影重要性(VIP)值來綜合評價。標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)的絕對值越大,在回歸方程中的權(quán)重就越大,該自變量對因變量的影響也就越顯著[23]。若自變量的標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)為正,則與因變量呈正相關(guān),反之則為負相關(guān)。VIP 圖的縱坐標(biāo)值越大,說明該自變量對因變量的貢獻越大(圖3)。

圖3 PLSR方程的變量投影重要性圖Fig.3 Variable importance values of PLSR equation 1,2,3,4

3 結(jié)論

抗氧化活性與測試體系密切相關(guān),不同評價體系,反應(yīng)原理不一,評價結(jié)果有時存在較大差異?；瘕埞庖褐泻卸喾N類型的活性成分,由于其結(jié)構(gòu)不同,在不同的抗氧化體系中作用也顯示不同。所以,采用5種抗氧化方法,更能客觀真實地反應(yīng)火龍果提取物的抗氧化能力。本研究發(fā)現(xiàn),不同火龍果果肉液中活性成分的含量存在一定差異,使得提取液的抗氧化活性也差異顯著(P<0.05),“海南金都1號”火龍果中甜菜紅素和黃酮含量均最高,分別為76.77和9.00 mg/L,“廣西大紅龍”中總酚含量最高,達53.01 mg/L?！昂Ｄ辖鸲?號”總抗氧化能力最高,達39.02 U/mL,“廣西桂紅龍1號”清除·OH能力最高為2.18 U/mL。Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),除·OH清除能力外,甜菜紅素含量與其他4種抗氧化能力具有極顯著正相關(guān)(r=0.936～0.955),黃酮含量與各抗氧化能力間相關(guān)性較強(r=0.717～0.956),而總酚與抗氧化能力無顯著相關(guān)性(P>0.05)。