魏竹君,于少軒,楊 武,王善鈺,宋元達(dá)

(山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院,山東淄博 255000)

還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸組成的含活性巰基的三肽,在生物體內(nèi)廣泛存在且具有多種重要的生理功能,如抗氧化、解毒、消除疲勞、延緩衰老、預(yù)防糖尿病和癌癥以及參與體內(nèi)三羧酸循環(huán)和糖代謝等[1]。近年來(lái),GSH也被廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)。例如,它可以作為營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)劑被添加到肉制品中,增強(qiáng)肉類的風(fēng)味;也可以作為抗氧化劑被添加到酸奶、嬰兒食品以及蔬菜類食品中,防止食品發(fā)生氧化、褐變等不良反應(yīng),保持其原有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2]。但是GSH穩(wěn)定性較差,容易被氧化,而且不易透過(guò)細(xì)胞膜,生物利用率較低,因此,其在食品中的應(yīng)用受到了限制。

脂質(zhì)體是由磷脂雙分子層組成的一種有效傳遞系統(tǒng),可用于包埋親水性和疏水性成分,具有靶向、緩釋、降低毒性和提高藥物的穩(wěn)定性等作用[3]。由于其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì),脂質(zhì)體被廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。然而,脂質(zhì)體在貯藏過(guò)程中其結(jié)構(gòu)容易受到光照、酸、堿等的破壞,出現(xiàn)顆粒絮凝、粒徑變大、藥物釋放等問(wèn)題[4];另外,作為口服制劑的脂質(zhì)體在體內(nèi)消化吸收過(guò)程中,容易受到酸和酶的影響,使脂質(zhì)體磷脂壁發(fā)生水解,磷脂雙分子層受到破壞,從而使被包埋的物質(zhì)泄漏出來(lái),這些問(wèn)題大大限制了脂質(zhì)體的實(shí)際應(yīng)用[5-6]。研究表明,對(duì)脂質(zhì)體表面進(jìn)行修飾可以提高其穩(wěn)定性,且目前已有大量關(guān)于殼聚糖[7]、聚乙二醇[8]、蛋白質(zhì)[9]等單一聚合物修飾脂質(zhì)體的研究報(bào)道。但由于修飾過(guò)程中脂質(zhì)體與修飾層間的結(jié)合力較弱,結(jié)構(gòu)松散,所形成的單層修飾的脂質(zhì)體的貯藏穩(wěn)定性并不理想[10-11]。因此需要雙層或多層修飾來(lái)提高其穩(wěn)定性。

殼聚糖和海藻酸鈉作為天然的聚陽(yáng)離子型多糖和聚陰離子型多糖,具有良好的生物相容性、生物可降解性和黏附性,被廣泛應(yīng)用于活性成分包埋[12-14]。殼聚糖在酸性溶液中呈現(xiàn)陽(yáng)離子性質(zhì),可以通過(guò)靜電作用與帶負(fù)電的脂質(zhì)體結(jié)合,在脂質(zhì)體表面形成一層保護(hù)膜[15]。Shalaby等[16]研究發(fā)現(xiàn)用殼聚糖修飾的脂質(zhì)體比未修飾的脂質(zhì)體具有更高的穩(wěn)定性和更強(qiáng)的緩釋功能。普遍認(rèn)為殼聚糖修飾的脂質(zhì)體是一種很有潛力的載體,能夠用于包埋其他具有生物活性的功能成分,進(jìn)而用于功能性食品的加工生產(chǎn)。Haidar等[17]用海藻酸鈉和殼聚糖對(duì)牛血清蛋白脂質(zhì)體進(jìn)行修飾測(cè)定其貯藏穩(wěn)定性,研究結(jié)果表明海藻酸鈉-殼聚糖雙層修飾脂質(zhì)體能夠大大增強(qiáng)其穩(wěn)定性。Sliva等[18]通過(guò)海藻酸鈉-殼聚糖對(duì)姜黃素脂質(zhì)體進(jìn)行了雙層修飾,并且發(fā)現(xiàn),在模擬體外消化過(guò)程中,被修飾的姜黃素脂質(zhì)體具有更高的抗氧化能力,并且能夠減少脂質(zhì)體的消化程度,增加其穩(wěn)定性,延長(zhǎng)其體內(nèi)外循環(huán)時(shí)間。但是消化過(guò)程中的脂質(zhì)體的緩釋機(jī)制尚未被研究。

在藥物運(yùn)載體系中,藥物釋放通常是一個(gè)很復(fù)雜的過(guò)程,受到眾多因素的影響,如藥物擴(kuò)散、溶蝕作用、不同機(jī)制之間相互作用[19]等。而脂質(zhì)體的釋藥過(guò)程往往是由幾種機(jī)制相互作用、共同控制的。而且在不同釋藥階段,每種釋藥機(jī)制的貢獻(xiàn)大小也會(huì)存在差異。因此,通過(guò)引入合適的動(dòng)力學(xué)模型,對(duì)脂質(zhì)體的藥物緩釋機(jī)理進(jìn)行深入研究對(duì)脂質(zhì)體的應(yīng)用具有重要指導(dǎo)意義。

本研究利用殼聚糖和海藻酸鈉正、負(fù)電荷的靜電作用層層交替對(duì)制備的GSH脂質(zhì)體進(jìn)行了雙層修飾,構(gòu)建出了殼聚糖-海藻酸鈉雙層修飾的GSH納米脂質(zhì)體。通過(guò)考察脂質(zhì)體粒徑、分散系數(shù)、電位的變化,以及脂質(zhì)體修飾前后的貯藏穩(wěn)定性和體外消化穩(wěn)定性,表征了殼聚糖和海藻酸鈉修飾對(duì)脂質(zhì)體的影響,利用各種數(shù)學(xué)模型分析了脂質(zhì)體在體外模擬胃腸道消化環(huán)境中釋放GSH的可能機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

還原型谷胱甘肽 山東金城生物藥業(yè)有限公司;大豆卵磷脂、胃蛋白酶(酶比活力:1∶15000)、胰蛋白酶(酶比活力:1∶2500) 上海麥克林生化科技有限公司;膽固醇、還原型谷胱甘肽含量檢測(cè)試劑盒 索萊寶生物科技有限公司;吐溫80、殼聚糖、海藻酸鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其余常規(guī)試劑 均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Zetasizer Nano-ZS90納米粒度及電位分析儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司;UV-2600紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;Multiskan FC型酶標(biāo)儀 賽默飛世爾(上海)儀器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;FE20pH儀 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;KYC-100B恒溫培養(yǎng)搖床 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;FG-18磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;KQ-700E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;JY99-ⅡD超聲破碎儀 北京佳源興業(yè)科技有限公司;傅里葉變換中紅外光譜儀 美國(guó)熱電尼高力儀器公司;場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡Apreos 美國(guó)Thermo公司;真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GSH納米脂質(zhì)體(Lip)的制備 Lip的制備參考Lasic[20]的制備方法,并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。將大豆卵磷脂、膽固醇和吐溫80按照質(zhì)量比為4∶1∶1.6的比例加到15 mL無(wú)水乙醇中使得膽固醇的濃度為4.17 mg/mL,將混合溶液倒入圓底燒瓶,并在50 ℃、0.1 MPa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30 min,以除去有機(jī)相并在瓶壁形成均勻透明的薄膜。然后向圓底燒瓶加入20 mL溶解有80 mg GSH的PBS溶液(0.05 mol/L,pH6.0),在50 ℃、常壓條件下繼續(xù)旋轉(zhuǎn)水合30 min,將薄膜洗脫下來(lái),然后將洗脫下來(lái)的溶液在冰浴中超聲10 min,靜置2 h,得到GSH納米脂質(zhì)體溶液,所得的樣品于4 ℃保存。

1.2.2 Lip的雙層修飾 將1 mL Lip溶液加到1 mL注射器中,然后按照體積比為1∶1的比例逐滴緩慢地滴加到pH6.0的殼聚糖溶液(0.1 g/100 mL)中,邊攪拌邊加入,待Lip溶液滴加完全后,將得到的混合溶液靜置2 h,使殼聚糖充分包裹到納米脂質(zhì)體表面,即得到殼聚糖修飾的GSH納米脂質(zhì)體(CH-Lip)[21]。

將上述制得的CH-Lip置于注射器中,按照體積比為1∶1的比例逐滴滴加到pH6.0的海藻酸鈉溶液(0.1 g/100 mL)中,邊攪拌邊加入,待CH-Lip溶液滴加完全,靜置2 h,即得雙層修飾GSH納米脂質(zhì)體(AL-CH-Lip),所得的樣品于4 ℃下保存。

1.2.3 粒徑、分散系數(shù)和Zeta電位測(cè)定 取1 mL AL-CH-Lip樣品、CH-Lip樣品和Lip樣品,分別用超純水稀釋3、5和10倍,然后用電位-粒度分析儀測(cè)定三種樣品的粒徑、分散系數(shù)和Zeta電位,測(cè)定條件為20 ℃,磷脂和分散介質(zhì)的折射率比值為1.330[22]。每個(gè)樣品平行測(cè)定三次以上。

1.2.4 微觀形貌觀察 將AL-CH-Lip樣品、CH-Lip樣品和Lip樣品分別用超純水稀釋3、5和10倍,然后滴加到硅片上,自然風(fēng)干過(guò)夜,真空噴金鍍膜,最后在掃描電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.5 紅外光譜表征 將一定體積的Lip樣品、CH-Lip樣品和AL-CH-Lip樣品在真空冷凍干燥機(jī)中凍干后,稱取1 mg樣品與150 mg KBr在瑪瑙研缽中研磨混合,并置于模具中壓成透明薄膜[23],然后將薄膜放到進(jìn)行紅外光譜分析儀中測(cè)定,掃描范圍為400～4000 cm-1。

1.2.6 Lip包埋率的測(cè)定 精密量取脂質(zhì)體100 μL,加入500 μL蒸餾水3000 r/min離心10 min,再加入200 μL蒸餾水離心10 min,精密量取超濾離心管外液體100 μL稀釋10倍[24],利用GSH含量檢測(cè)試劑盒測(cè)得游離GSH含量,按式(1)計(jì)算包埋率。

式(1)

式中:Wtotal為制備時(shí)加入的GSH總量,mg;Wfree為測(cè)得的游離GSH的量,mg。

1.2.7 貯藏穩(wěn)定性試驗(yàn) 將Lip、CH-Lip、AL-CH-Lip貯藏于室溫條件下,并于第1、3、5、7、9、11、25、39、60 d取樣,測(cè)定釋放到溶液中的GSH的量,并根據(jù)式(2)計(jì)算GSH釋放率。

式(2)

式中:Et為時(shí)間t測(cè)定的游離GSH濃度,mg/mL;E0為0 d時(shí)測(cè)定的游離的GSH濃度,mg/mL;Etotal為制備時(shí)GSH的濃度,mg/mL。

1.2.8 體外消化穩(wěn)定性研究

1.2.8.1 模擬消化液的制備 參考Dupont等[25]的方法配制模擬胃液和模擬腸液。

模擬胃液:稱取2 g氯化鈉溶解于10 mL蒸餾水中,量取7 mL市售濃鹽酸溶液,混合均勻后,用0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至1.2后定容至1 L容量瓶中。其中,胃蛋白酶在消化實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)加入,其質(zhì)量濃度為3.2 mg/mL。制備完成的溶液貯藏于4 ℃。

模擬腸液:稱取6.8 g磷酸氫二鉀溶于蒸餾水中,然后準(zhǔn)確量取190 mL濃度為0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液,混合均勻,然后用0.01 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.4后定容到1 L。胰酶和膽汁在消化實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)加入,其中,胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為3.2 mg/mL,膽汁濃度為0.2 mg/mL。制備完成的溶液貯藏于4 ℃。

1.2.8.2 體外模擬胃、腸單獨(dú)消化 分別將Lip、CH-Lip、AL-CH-Lip與模擬胃液或模擬腸液分別按照1∶3、2∶3、4∶3體積混合,在37 ℃、95 r/min搖床中孵育以模擬消化反應(yīng),以酶加入的瞬間作為反應(yīng)的開(kāi)始時(shí)間,每隔一定消化時(shí)間取樣分析,取樣時(shí)間為0、5、15、30、60、120、240 min[26-27]。測(cè)定樣品中GSH的含量,并根據(jù)式(3)計(jì)算。每個(gè)樣品平行測(cè)試三次。

式(3)

式中:Em為時(shí)間m分鐘時(shí)測(cè)定的游離GSH含量,mg;En為反應(yīng)開(kāi)始時(shí)間時(shí)測(cè)定的游離的GSH含量,mg;Etotal為制備時(shí)加入的GSH總量,mg。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0、Origin 8.0、DDsolver等[28]數(shù)據(jù)處理和繪圖軟件進(jìn)行分析作圖,以P<0.01為差異極顯著,P<0.05為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip的粒徑、分散系數(shù)和Zeta電位變化

納米顆粒的大小直接影響包埋物的載量、釋放、生物利用率以及體內(nèi)分布和靶向性?？刂屏Ｗ拥拇笮『瞳@得較窄均勻的粒度分布是制備納米顆粒的關(guān)鍵[7]。

由圖1可知,Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip的平均粒徑分別為(77.72±0.87)、(93.81±1.56)nm和(94.44±1.71)nm,即Lip經(jīng)殼聚糖單獨(dú)修飾或殼聚糖和海藻酸鈉雙層修飾后粒徑分別增大了16.09 nm和16.72 nm,初步證明了殼聚糖和海藻酸鈉包裹在了脂質(zhì)體表面。另外,與Lip的分散系數(shù)相比,CH-Lip和AL-CH-Lip的分散系數(shù)有一定程度增加,但其值仍小于0.4。這可能是因?yàn)闅ぞ厶桥c海藻酸鈉修飾在脂質(zhì)體的外層使脂質(zhì)體的表面毛糙,部分未成功修飾的殼聚糖和海藻酸鈉使整個(gè)體系的分布更為分散。Alshraim等[29]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)脂質(zhì)體表面進(jìn)行殼聚糖修飾,其粒徑跟分散系數(shù)也會(huì)有一定程度增大,與本研究結(jié)果相似。

圖1 Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip的粒徑及分散系數(shù)Fig.1 Particle size and polydispersity index(PDI)of Lip,CH-Lip and AL-CH-Lip

Zeta電位能夠衡量電荷的多少,修飾劑的存在會(huì)改變脂質(zhì)體表面的帶電情況,分析修飾前后脂質(zhì)體的電位值可以判斷修飾劑是否成功修飾在脂質(zhì)體的表面。

由圖2可知,Lip的Zeta電位為(-27.2±0.03) mV,經(jīng)殼聚糖修飾后變?yōu)?20.47±0.65) mV,再經(jīng)海藻酸鈉修飾后變?yōu)?-42.57±0.91) mV。磷酸基團(tuán)的存在使脂質(zhì)體Zeta電位為負(fù)值,而殼聚糖攜帶大量的正電荷,當(dāng)殼聚糖包裹于脂質(zhì)體表面時(shí),脂質(zhì)體的Zeta電位變化為正值。類似地,Zhou等[30]也發(fā)現(xiàn)用殼聚糖對(duì)脂質(zhì)體表面進(jìn)行修飾時(shí),隨著殼聚糖用量增加,脂質(zhì)體Zeta電位也不斷增加。同理,海藻酸鈉分子帶有大量負(fù)電荷,也能通過(guò)靜電作用緊緊包裹于殼聚糖的表面,使經(jīng)殼聚糖修飾的脂質(zhì)體的Zeta電位由正值變?yōu)樨?fù)值[31]。Zeta電位的變化進(jìn)一步證實(shí)了殼聚糖和海藻酸鈉通過(guò)靜電吸附的方式成功包裹在了脂質(zhì)體表面。

圖2 Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip的Zeta電位Fig.2 Zeta potential of Lip,CH-Lip and AL-CH-Lip

2.2 微觀形貌表征

為了了解Lip修飾前后的形貌變化,采用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)對(duì)Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip 3個(gè)樣品進(jìn)行了觀察,結(jié)果如圖3所示。由圖3a可知,Lip為球形,在SEM下呈亮白色。殼聚糖修飾后,如圖3b所示,CH-Lip仍然是球形顆粒,但其外圍有一層透明狀的物質(zhì),這應(yīng)該是包裹于Lip外層的殼聚糖。AL-CH-Lip也呈球形,并且外層也有一圈淡淡的物質(zhì),這應(yīng)該是CH-Lip上包裹的海藻酸鈉(圖3c)。因此,SEM結(jié)果進(jìn)一步證明了殼聚糖與海藻酸鈉包裹在了Lip表面。Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip的粒徑大小分布在70～100 nm范圍內(nèi),與粒度儀測(cè)量的結(jié)果接近。

圖3 Lip(a)、CH-Lip(b)和AL-CH-Lip(c)的掃描電子顯微鏡圖像(300000×)Fig.3 SEM images of Lip(a),CH-Lip(b)and AL-CH-Lip(c)(300000×)

2.3 傅里葉變換中紅外光譜表征

利用傅里葉變換中紅外光譜儀可以測(cè)定Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip的化學(xué)結(jié)構(gòu),進(jìn)而推測(cè)修飾引起的化學(xué)鍵的變化情況,證明Lip的外層成功包裹上了殼聚糖與海藻酸鈉,結(jié)果如圖4所示。脂質(zhì)體磷脂雙分子層界面可以用C=O和P=O這兩種極性基團(tuán)表征。Lip的光譜中1739 cm-1為C=O的伸縮振動(dòng)[32],1241 cm-1為P=O的對(duì)稱振動(dòng)[33],2926和2855 cm-1處的吸收峰為脂質(zhì)體雙分子層內(nèi)部的丙烯鏈的對(duì)稱和不對(duì)稱CH2伸縮振動(dòng)[34]。對(duì)比Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip的光譜可以發(fā)現(xiàn),丙烯的對(duì)稱和不對(duì)稱CH2伸縮振動(dòng)在CH-Lip(2925和2854 cm-1)和AL-CH-Lip(2924和2853 cm-1)中基本保持不變。但是,代表C=O的吸收峰則在CH-Lip和AL-CH-Lip中分別移動(dòng)至1700和1706 cm-1,說(shuō)明在修飾脂質(zhì)體的過(guò)程中有新的氫鍵的形成或者是氫鍵有所加強(qiáng)[22];另外,代表P=O基團(tuán)表征的吸收峰在CH-Lip和AL-CH-Lip中出現(xiàn)于1235和1231 cm-1,說(shuō)明殼聚糖與納米脂質(zhì)體之間有新的氫鍵的形成,證明殼聚糖成功的包裹在脂質(zhì)體的表面。殼聚糖中的氨基的特征峰出現(xiàn)在1655 cm-1[35],海藻酸鈉中的羧基的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)的特征峰出現(xiàn)在1614 cm-1[36],在CH-Lip和AL-CH-Lip中這些特征峰消失,這說(shuō)明殼聚糖與海藻酸鈉發(fā)生相互作用,海藻酸鈉成功包裹在了CH-Lip的表面。

圖4 Lip、CH-Lip、AL-CH-Lip、殼聚糖和海藻酸鈉的傅里葉紅外圖譜Fig.4 FTIR spectra of Lip,CH-Lip,AL-CH-Lip chitosan and alginate

2.4 Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip的GSH包埋率

藥物的包埋率是評(píng)價(jià)納米顆粒質(zhì)量和應(yīng)用價(jià)值的重要指標(biāo),能夠反映整個(gè)脂質(zhì)體體系在制備過(guò)程中GSH的保留率。

由圖5可知,Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip對(duì)GSH的包埋率分別為67.5%±0.82%、85.5%±0.65%、93.5%±0.16%,即經(jīng)殼聚糖修飾、殼聚糖和海藻酸鈉雙層修飾后,脂質(zhì)體對(duì)GSH的包埋率分別增加了18.0%和26.0%。包埋率的增加可能是有兩方面原因,一是殼聚糖與海藻酸鈉在結(jié)合到脂質(zhì)體表面的過(guò)程中,游離的GSH也被包埋到了顆粒表面;二是殼聚糖與海藻酸鈉在脂質(zhì)體表面形成致密的修飾層,避免了GSH的釋放[37]。白春清等[38]利用殼聚糖和果膠多層修飾脂質(zhì)體的結(jié)果也表明雙層修飾后其包埋率會(huì)大大增加,與本研究結(jié)果相似。

圖5 Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip的包埋率Fig.5 Loading efficiency of glutathione in Lip,CH-Lip and AL-CH-Lip

2.5 貯藏穩(wěn)定性

由于脂質(zhì)體在貯藏過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)顆粒絮凝、粒徑變大、藥物釋放等問(wèn)題,因此,修飾脂質(zhì)體的貯藏穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)載體系統(tǒng)的重要指標(biāo)之一。由圖6可知,在室溫貯藏過(guò)程中,隨著時(shí)間不斷延長(zhǎng),Lip、CH-Lip、AL-CH-Lip中GSH的釋放率不斷增加。其中,Lip的釋放率最高,在常溫貯藏60 d后,其GSH釋放率高達(dá)16.23%±1.13%。而兩種經(jīng)過(guò)修飾的脂質(zhì)體的釋放率明顯低于未修飾的脂質(zhì)體的釋放率,并且AL-CH-Lip的釋放率最低,60 d后釋放率僅為9.96%±0.99%。因此,將脂質(zhì)體表面進(jìn)行修飾能夠明顯提高其在室溫下的貯藏穩(wěn)定性,且雙層修飾的脂質(zhì)體具有更高的穩(wěn)定性。

圖6 Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip中GSH在貯藏過(guò)程中的釋放Fig.6 GSH release from Lip,CH-Lipand AL-CH-Lip during storage

2.6 體外消化穩(wěn)定性

脂質(zhì)體進(jìn)入胃腸道之后很容易被強(qiáng)酸強(qiáng)堿性的消化液破壞,導(dǎo)致脂質(zhì)體中包埋的物質(zhì)泄漏,降低其生物利用度。為了表征修飾前后的脂質(zhì)體對(duì)谷胱甘肽運(yùn)載及吸收效果的影響,將運(yùn)載谷胱甘肽的修飾前后的脂質(zhì)體進(jìn)行體外模擬消化實(shí)驗(yàn)。

由圖7可知,Lip、CH-Lip、AL-CH-Lip在體外模擬胃消化過(guò)程中,GSH的釋放都呈現(xiàn)先快后慢的趨勢(shì),但Lip的釋放率明顯高于兩種經(jīng)修飾的脂質(zhì)體的釋放率。在胃消化開(kāi)始后60 min內(nèi),Lip的釋放率達(dá)到了45.99%±2.50%,而CH-Lip與AL-CH-Lip的釋放率分別為12.42%±1.04%和5.72%±1.56%。當(dāng)消化時(shí)間為120 min時(shí),三種脂質(zhì)體基本達(dá)到了最大的GSH釋放率,Lip、CH-Lip、AL-CH-Lip的釋放率分別為48.02%±3.02%、21.90%±1.18%、7.63%±1.64%。之后,三種脂質(zhì)體的GSH釋放率都沒(méi)有明顯改變。在胃消化過(guò)程中,Lip中GSH的釋放率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CH-Lip和AL-CH-Lip。這可能是因?yàn)楹Ｔ逅徕c能夠降低胃蛋白酶的活,并且根據(jù)Cuomo等[39]研究表明,殼聚糖在胃酸中能夠降低藥物的釋放。因此,AL-CH-Lip在胃液中具有更高的穩(wěn)定性,這有利于將更多被包埋的GSH運(yùn)輸?shù)叫∧c中。

圖7 Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip中GSH在模擬胃消化過(guò)程中的釋放Fig.7 GSH release from Lip,CH-Lipand AL-CH-Lip in simulated gastric digestion

由圖8可知,在體外模擬腸道消化過(guò)程中,Lip呈現(xiàn)一種隨著時(shí)間不斷增加其包裹的GSH的釋放率也不斷的增加的趨勢(shì),當(dāng)消化時(shí)間為240 min時(shí),其釋放率到了88.81%±1.73%;而CH-Lip與AL-CH-Lip呈現(xiàn)的是先快速釋放后進(jìn)入緩慢釋放的趨勢(shì),當(dāng)消化時(shí)間為30 min時(shí),CH-Lip和AL-CH-Lip基本達(dá)到了最大的GSH釋放率,分別為26.14%±1.14%和8.92%±0.63%。之后,這兩種脂質(zhì)體的GSH的釋放率都沒(méi)有明顯變化。因此,在模擬腸消化的整個(gè)過(guò)程中,未修飾的脂質(zhì)體比修飾的脂質(zhì)體釋放出更多的GSH。

圖8 Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip中GSH在模擬腸消化過(guò)程中的釋放Fig.8 GSH release from Lip,CH-Lipand AL-CH-Lip in simulated intestinal digestion

脂質(zhì)體在腸液中對(duì)GSH的釋放率明顯高于其在胃液中對(duì)GSH的釋放率。這可能是因?yàn)槟c液中胰酶對(duì)脂質(zhì)體外層磷脂的水解作用以及膽鹽的增溶作用導(dǎo)致脂質(zhì)體水解破裂[40],而釋放出大量GSH。而包裹于脂質(zhì)體表面的殼聚糖與海藻酸鈉能夠阻隔腸液中的胰酶和膽鹽與脂質(zhì)體外層的磷脂接觸,從而保護(hù)脂質(zhì)體的完整性,使被包裹的GSH不易滲出。納米脂質(zhì)體可以通過(guò)腸表面的粘膜層被吸收,據(jù)Sahay等[41]研究發(fā)現(xiàn),納米粒子可以被上皮細(xì)胞通過(guò)主動(dòng)或被動(dòng)運(yùn)輸機(jī)制直接吸收。所以,被雙層修飾的脂質(zhì)體能夠大大提高GSH的生物利用率。

2.7 脂質(zhì)體體外釋放曲線擬合與釋放機(jī)理

在藥物釋放機(jī)制的分析中經(jīng)常采用的模型方程有零級(jí)釋放方程、一級(jí)釋放方程、Higuchi釋放方程、Makoid-Banakar方程和Peppas-Sahlin方程。為了更好地理解Lip、CH-Lip、AL-CH-Lip在模擬消化過(guò)程中釋放GSH的機(jī)制,通過(guò)DDsolver軟件分別用上述五種釋放模型對(duì)不同脂質(zhì)體在模擬胃腸消化過(guò)程中GSH的釋放進(jìn)行了擬合。結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 不同脂質(zhì)體在模擬胃消化道釋放動(dòng)力學(xué)和控釋機(jī)制Table 1 The dynamics and controlled release mechanism of different liposomes in simulated gastric tract release

由表1可知,Makoid-Banakar模型和Peppas-Sahlin模型對(duì)于三種脂質(zhì)體在體外模擬胃消化道釋放曲線的最小信息標(biāo)準(zhǔn)(AIC)較小且模型選擇標(biāo)準(zhǔn)值(MSC)較大,擬合效果較好。其中Makoid-Banakar模型擬合結(jié)果中的指數(shù)n值可以用來(lái)描述藥物的釋放機(jī)理:當(dāng)n<0.45時(shí),釋放模型的藥物是擴(kuò)散型;當(dāng)0.45≤n≤0.89時(shí),釋放模型的藥物為擴(kuò)散和溶蝕型兼有;當(dāng)n>0.89時(shí),藥物釋放模型為溶蝕型[42-43]。如表1中所示,Lip、CH-Lip、AL-CH-Lip經(jīng)Makoid-Banakar模型擬合得到的n值分別為0.701、0.791和0.730,說(shuō)明三種脂質(zhì)體的釋放模型均為擴(kuò)散和溶蝕型兼有[44]。Peppas-Sahlin動(dòng)力學(xué)方程對(duì)釋藥機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。右邊第一項(xiàng)表示Fick擴(kuò)散作用對(duì)藥物釋放過(guò)程的貢獻(xiàn),而第二項(xiàng)表示基質(zhì)溶蝕作用對(duì)藥物釋放過(guò)程的貢獻(xiàn)即k1和k2分別表示擴(kuò)散作用和溶蝕作用速率常數(shù)。如表2所示,三種脂質(zhì)體的k1>k2,即GSH主要是從脂質(zhì)體中擴(kuò)散釋放,另有一小部分GSH通過(guò)溶蝕釋放。

表2 不同脂質(zhì)體在模擬腸消化道釋放動(dòng)力學(xué)和控釋機(jī)制Table 2 The dynamics and controlled release mechanism of different liposomes in simulated intestinal tract release

通過(guò)引入Fick擴(kuò)散貢獻(xiàn)比(R),可以進(jìn)一步評(píng)價(jià)Fick擴(kuò)散作用在模擬胃消化道中GSH釋放過(guò)程中貢獻(xiàn)大小的變化。根據(jù)式(4)計(jì)算R值。

式(4)

式中:k1表示擴(kuò)散作用速率常數(shù),m2min-1;k2表示溶蝕作用速率常數(shù),m2min-1;m表示Fick擴(kuò)散指數(shù);t表示某一時(shí)刻,min。

圖9進(jìn)一步考察三種脂質(zhì)體在模擬胃消化道過(guò)程中各個(gè)時(shí)間點(diǎn)累積釋放量中擴(kuò)散和溶蝕所占的比例,可以發(fā)現(xiàn)三組脂質(zhì)體釋放時(shí)擴(kuò)散機(jī)制所占比例均隨釋放時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減小,但仍占據(jù)主導(dǎo)地位。當(dāng)釋放時(shí)間從0 min增加到240 min時(shí),擴(kuò)散機(jī)制所占比例從1分別減小到0.605、0.689、0.717;相反地,溶蝕機(jī)制所占的比例則相應(yīng)增大,由初始0分別增大到0.395、0.311、0.283。因此,脂質(zhì)體的修飾層數(shù)越多,在整個(gè)釋放周期中溶蝕比例增加速度越慢,與前面海藻酸鈉-殼聚糖雙層修飾的脂質(zhì)體在4 h內(nèi)累積釋放量明顯低于未修飾的脂質(zhì)體的釋放量的結(jié)果一致,說(shuō)明海藻酸鈉-殼聚糖雙層修飾的脂質(zhì)體可以通過(guò)影響釋放的溶蝕行為,起到延緩GSH的釋放率。

圖9 Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip的Fick擴(kuò)散貢獻(xiàn)比RFig.9 Fick diffusion contribution ratio R of Lip,CH-Lip and AL-CH-Lip

由表2的結(jié)果可知,Makoid-Banakar模型和Peppas-Sahlin模型對(duì)于三種脂質(zhì)體在體外模擬腸道釋放曲線擬合較好,最小信息標(biāo)準(zhǔn)(AIC)較小,且模型選擇標(biāo)準(zhǔn)值(MSC)較大。根據(jù)Makoid-Banakar模型擬合結(jié)果中的n值可以看出,三種脂質(zhì)體在腸道的釋放模型均是擴(kuò)散型。

上述結(jié)果表明,未修飾的脂質(zhì)體與被修飾的脂質(zhì)體在釋放GSH時(shí)存在一定差異,可能是因?yàn)樾揎椢镌谥|(zhì)體表面的殼聚糖和海藻酸鈉作為擴(kuò)散溶質(zhì)的物理屏障,在GSH釋放過(guò)程中起到了位阻作用[45]。Hasan等[46]在研究殼聚糖修飾前后的脂質(zhì)體在水溶液中釋放姜黃素的過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)被修飾的脂質(zhì)體的釋放率明顯低于被修飾的脂質(zhì)體的釋放率,與本研究結(jié)果相似。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)先通過(guò)薄膜-超聲法制備了GSH納米脂質(zhì)體Lip,然后用殼聚糖和海藻酸鈉對(duì)其表面進(jìn)行了修飾。結(jié)果表明,經(jīng)海藻酸鈉-殼聚糖雙層修飾后,Lip的粒徑從(77.72±0.87) nm增加到了(94.44±1.71) nm,Zeta電位由(-27.20±0.03) mV變?yōu)?-42.57±0.91) mV,GSH包埋率從67.5%±0.82%增加到93.5%±0.16%。通過(guò)SEM結(jié)果可以看出,修飾前后Lip的形貌沒(méi)有變化,均為球形,而且海藻酸鈉與殼聚糖修飾在納米脂質(zhì)體的表面。通過(guò)傅里葉變換中紅外光譜上各官能團(tuán)吸收峰位置和強(qiáng)度變化進(jìn)一步證明,海藻酸鈉與殼聚糖成功修飾在了脂質(zhì)體表面。貯藏穩(wěn)定性與胃腸道穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,海藻酸鈉-殼聚糖雙層修飾顯著增強(qiáng)了GSH納米脂質(zhì)體的穩(wěn)定性,使其在胃腸道中釋放GSH的速率顯著降低。因此,在復(fù)雜的食品加工體系中,使用殼聚糖-海藻酸鈉雙層修飾的脂質(zhì)體可以避免GSH的過(guò)快釋放,增加GSH的穩(wěn)定性,從而促進(jìn)胃腸道細(xì)胞對(duì)GSH的吸收,增加食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。該研究結(jié)果為海藻酸鈉-殼聚糖雙層修飾的GSH納米脂質(zhì)體在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了參考依據(jù)和一定的數(shù)據(jù)支持。