孫琳珺，胡麗麗，田世紅，王 翔，劉 弘，羅寶章，宋 夏，楊京津，董慶利

(1.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.上海市疾病預(yù)防控制中心，上海 200336)

近年來，全球食源性疾病頻發(fā)，受到公眾的廣泛關(guān)注。2018年，歐盟報(bào)道了91 662起由沙門氏菌引起的病例，其中西班牙報(bào)道了9 526起[1]。原國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委辦公廳2015年發(fā)布數(shù)據(jù)，表明全國(guó)由致病微生物導(dǎo)致的食物中毒事件顯著高于其他危害，發(fā)病率占總數(shù)的53.7%(3 181/5 926)，其中沙門氏菌是引起食源性疾病的主要致病菌之一[2]，廣泛存在于自然界中，尤其存在于畜禽肉與蛋類等食品中[3]。當(dāng)大量攝入(105～106個(gè)/g)時(shí)將會(huì)引起傷寒和副傷寒、急性腸胃炎等疾病，具有相當(dāng)高的風(fēng)險(xiǎn)[4]，近年來在陜西省漢中市[5]和四川省成都市[6]的監(jiān)測(cè)中都有沙門氏菌的高檢出率。

微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估(microbial risk assessment,MRA)可從科學(xué)角度有效控制食品生產(chǎn)加工過程中可能的微生物危害，降低食品安全風(fēng)險(xiǎn)[7]。微生物半定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估(semi-quantitative microbial risk assessment)是使用評(píng)分或賦值的方式或者借助半定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估軟件對(duì)風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生的可能性及嚴(yán)重程度進(jìn)行計(jì)算和描述[8]，如澳大利亞的Risk ranger軟件[9-10]、荷蘭Evers等[11]開發(fā)的快速定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具(swift quantitative microbiological risk assessment,sQMRA)。sQMRA工具通過分析從零售階段開始致病菌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，設(shè)置包括交叉污染等11個(gè)參數(shù)，從而推測(cè)特定食品-致病菌組合的發(fā)病率和感染人數(shù)。朱江輝等[12]運(yùn)用sQMRA工具對(duì)2008年9—11月牡蠣中副溶血性弧菌的11個(gè)參數(shù)進(jìn)行推演。交叉污染作為引起食源性疾病爆發(fā)的重要因素之一，其參數(shù)設(shè)置至關(guān)重要，包括交叉污染比例(Scc/r)交叉污染菌量減少比例(Fcc)以及交叉污染菌量攝入比例(Fei)3個(gè)交叉污染參數(shù)有待深入探討。

基于此，本文中，筆者以腸炎沙門氏菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中2 組典型的食源性致病菌-食品組合(腸炎沙門氏菌-雞蛋，腸炎沙門氏菌-牛肉)的交叉污染參數(shù)為切入點(diǎn)，通過消費(fèi)習(xí)慣法調(diào)研和實(shí)證研究2種方式對(duì)sQMRA工具中的3個(gè)交叉污染參數(shù)進(jìn)一步明確，為更好運(yùn)行工具開展半定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腸炎沙門氏菌(ATCC13076)，ATCC；雞蛋、棉簽、牛肉、案板、刀具，上海卜蜂蓮花超市，樣品均放于4 ℃冷藏冰箱中備用；胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯培養(yǎng)基(BPW)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(HE)、無(wú)菌均質(zhì)袋、手套，青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-S 75SII型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠；電磁爐，上?；蹆x儀器廠；XW-80A 型漩渦混合器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；Scientz-09型無(wú)菌均質(zhì)器，浙江寧波新芝生物科技股份有限公司；SW-CJ-IC型超凈工作臺(tái)、SPX-250B-II 型生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；100～1 000 μL、20～100 μL 移液槍，艾本德公司；JT302N 型電子天平，上海精天電子儀器有限公司。

1.3 菌種制備、介質(zhì)及樣品滅菌

取保藏于-80 ℃的甘油保藏管[13]中的腸炎沙門氏菌移至BPW培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，隨后于TSA培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，將已劃線平板置于(4±0.5) ℃冰箱中臨時(shí)保存。使用時(shí)在已劃線平板上挑取單菌落，接種于BPW培養(yǎng)基中，于 37 ℃、140 r/min搖床中培養(yǎng)16～18 h至穩(wěn)定期，經(jīng)生理鹽水稀釋得到108CFU/mL 的初始菌懸液備用。

試驗(yàn)中對(duì)案板、刀具、手套等進(jìn)行相應(yīng)滅菌方式見表1。其中雞蛋和牛肉在滅菌后置于(4±0.5)℃冰箱中儲(chǔ)藏備用。

表1 交叉污染試驗(yàn)中各介質(zhì)的滅菌方式

1.4 兩組食源性致病菌-食品組合的Scc/r參數(shù)調(diào)研

確定腸炎沙門氏菌-雞蛋，腸炎沙門氏菌-牛肉2組Scc/r參數(shù)，通過專家啟發(fā)法獲取交叉污染發(fā)生比例[14]并結(jié)合上海市消費(fèi)者習(xí)慣調(diào)研廚房階段不同食物烹飪方式占比。其中，腸炎沙門氏菌-雞蛋組合中的烹飪方式包括煮、炒、生食、蒸、烙、熟食、烤、生吃、其他；腸炎沙門氏菌-牛肉中的烹飪方式包括煮、炒、炸、蒸、烙、熟食、烤、其他。

1.5 腸炎沙門氏菌-雞蛋的Fcc和Fei參數(shù)確定

為確定腸炎沙門氏菌-雞蛋的Fcc和Fei參數(shù)，試驗(yàn)研究蛋殼及蛋液中腸炎沙門氏菌到手套上的轉(zhuǎn)移以及研究手套中腸炎沙門氏菌到熟雞蛋上的轉(zhuǎn)移。

試驗(yàn)根據(jù)實(shí)際情況，將蛋殼以及蛋液分為以下兩部分試驗(yàn)。

1)將蛋殼樣品(2 cm×2 cm)浸泡于載有1 mL初始菌懸液的培養(yǎng)皿中30 s。采用擦拭取樣法測(cè)定其中一份樣品表面帶菌量，確定初始接菌量。另一份樣品蛋殼置于手套上(2 cm×2 cm)接觸15 min，使用無(wú)菌鉗翻動(dòng)蛋殼樣品，使菌液均勻黏附于手套表面。15 min后移除蛋殼，采用擦拭取樣法測(cè)定手套表面帶菌量[15],計(jì)算Fcc參數(shù)值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2)取蛋液樣品24 mL于無(wú)菌均質(zhì)袋中，向均質(zhì)袋中加入1 mL初始菌懸液，并進(jìn)行均質(zhì)。將手套表面(2 cm×2 cm)放入蛋液中，靜置15 min，使菌液充分黏附在手套上。靜置后取出手套，通過擦拭取樣法測(cè)定手套表面帶菌量[15]，計(jì)算Fcc參數(shù)值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

取出已滅菌手套(2 cm×2 cm)于無(wú)菌操作臺(tái)中，接種1 mL初始菌懸液于手套，靜置15 min。靜置后對(duì)手套進(jìn)行3種不同清潔方式處理(S1：不清洗、S2：500 mL無(wú)菌水清洗瀝干、S3：500 mL洗潔精水清洗瀝干)。將手套覆蓋于去殼熟雞蛋表面(2 cm×2 cm)靜置15 min。靜置后取出手套，通過擦拭取樣法測(cè)定熟雞蛋表面帶菌量[16]，計(jì)算Fei參數(shù)值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 腸炎沙門氏菌-牛肉的Fcc和Fei參數(shù)確定

針對(duì)于腸炎沙門氏菌-牛肉的Fcc和Fei參數(shù)確定，測(cè)定生牛肉中腸炎沙門氏菌到3種廚房器具(刀具、案板、手套)的轉(zhuǎn)移以及單一介質(zhì)和組合介質(zhì)(圖1)中腸炎沙門氏菌到牛肉的轉(zhuǎn)移。

*假設(shè)在一種介質(zhì)轉(zhuǎn)移到另一種介質(zhì)當(dāng)中時(shí)，帶菌牛肉轉(zhuǎn)移到介質(zhì)上的菌量與介質(zhì)轉(zhuǎn)移至牛肉的菌量相同圖1 7種場(chǎng)景下不同介質(zhì)組合方式Fig.1 Combination mode of different media under seven scenarios

稱取 25 g無(wú)菌牛肉樣品放置于均質(zhì)袋中，移液1 mL初始菌懸液與樣品表面，靜置15 min，確保菌液均勻黏附在其表面。取出樣品加入225 mL生理鹽水后均質(zhì)，測(cè)定其初始接菌量。其余樣品分別放置于3種介質(zhì)(刀具、案板、手套，5 cm×5 cm)上，使用無(wú)菌鉗翻動(dòng)數(shù)次，使菌液重復(fù)黏附在介質(zhì)上，靜置15 min[15]。通過擦拭取樣法測(cè)定介質(zhì)表面菌量，計(jì)算Fcc參數(shù)值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

在3種不同的介質(zhì)(刀具、案板、手套，5 cm×5 cm)上接種1 mL初始接菌液，靜置15 min，將25 g無(wú)菌熟牛肉樣品分別接觸單個(gè)介質(zhì)或者多個(gè)介質(zhì)。測(cè)定接觸后熟牛肉菌量[15]，計(jì)算Fei參數(shù)值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 參數(shù)計(jì)算以及統(tǒng)計(jì)分析

Scc/r、Fcc和Fei這3個(gè)參數(shù)計(jì)算見式(1)～(3)。

Scc/r=PpAc

(1)

式中：Scc/r為陽(yáng)性樣品發(fā)生交叉污染比例；Pp為陽(yáng)性樣品發(fā)生交叉污染的概率；Ac為特定烹飪方式占該食品所有烹飪方式的比例。

(2)

式中：Fcc為交叉污染菌量減少比例；N0為初始陽(yáng)性樣品污染濃度；N1為接觸介質(zhì)與陽(yáng)性樣品接觸后帶菌量。

(3)

試驗(yàn)均進(jìn)行了2次平行，3次重復(fù)。試驗(yàn)中菌量測(cè)定均參照GB4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[17]，最終結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來呈現(xiàn)。采用SPSS (IBM SPSS Version 17.0)軟件對(duì)參數(shù)值進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。通過配對(duì)T檢驗(yàn)進(jìn)行組間顯著性比較(P<0.05)。使用Origin(OriginLab Version 8.0)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩組食源性致病菌-食品組合的Scc/r參數(shù)調(diào)研

根據(jù)公式計(jì)算結(jié)果，兩組食品-致病菌的Scc/r參數(shù)范圍為0.11%～44.85%。具體Scc/r參數(shù)值見表3。

表3 兩組食源性致病菌組合的Scc/r參數(shù)值

2.2 腸炎沙門氏菌-雞蛋的Fcc參數(shù)以及Fei參數(shù)確定

圖2為鮮蛋不同部位中腸炎沙門氏菌的Fcc參數(shù)。由圖2可知，鮮蛋中腸炎沙門氏菌的Fcc參數(shù)值為(2.59±0.28)%、(4.18±0.16)%。鮮蛋中細(xì)菌轉(zhuǎn)移率均較低，且蛋殼表面的轉(zhuǎn)移率略高于蛋液。2個(gè)場(chǎng)景下的Fcc參數(shù)值經(jīng)過顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛋殼和蛋液的Fcc參數(shù)具有顯著性差異(P<0.05)。這可能是由于不同粗糙程度對(duì)于細(xì)菌轉(zhuǎn)移的影響，粗糙介質(zhì)更有利于細(xì)菌的轉(zhuǎn)移，這與Vorst等[18]研究結(jié)果相一致。

圖2 不同鮮蛋部位中腸炎沙門氏菌的Fcc參數(shù)Fig.2 Fcc parameters of Salmonella enteritisin different eggs sections

圖3為在不同場(chǎng)景下鮮蛋中腸炎沙門氏菌的Fei參數(shù)。由圖3可知，3種場(chǎng)景下Fei參數(shù)值范圍為(0.02±0.00)%～(0.33±0.01)%，參數(shù)值都較低且呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。不處理、無(wú)菌水清洗以及洗潔精水清洗3組操作之間均存在顯著性差異(P<0.05)。結(jié)果表明，清洗處理可大大降低腸炎沙門氏菌的轉(zhuǎn)移量，Robinson等[19]通過試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)肥皂洗手或者使用手套可以在準(zhǔn)備食物階段大大減少細(xì)菌的轉(zhuǎn)移。多個(gè)研究都證明了這一點(diǎn)[20-23]。但是并不能完全去除致病菌的殘留，這可能是由于細(xì)菌黏附在介質(zhì)表面的緣故。

圖3 不同場(chǎng)景下鮮蛋中腸炎沙門氏菌的Fei參數(shù)Fig.3 Fei parameters of Salmonella enteritisin different scenarios

2.3 腸炎沙門氏菌-牛肉的Fcc參數(shù)以及Fei參數(shù)確定

圖4為不同接觸介質(zhì)下牛肉中腸炎沙門氏菌的Fcc參數(shù)。由圖4可知，3種接觸介質(zhì)下Fcc參數(shù)范圍為(43.68±9.16)%～(71.03%±16.82)%，3種介質(zhì)的Fcc參數(shù)值經(jīng)過顯著性分析均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。但是三者的參數(shù)值都呈現(xiàn)細(xì)菌的高轉(zhuǎn)移率，其中手部的Fcc參數(shù)值最高，高達(dá)(71.03±16.82)%，刀具與案板的Fcc參數(shù)值相近。可見操作者操作對(duì)于腸炎沙門氏菌的轉(zhuǎn)移具有巨大的影響。Chen等[24]和Hui等[25]也證實(shí)了這一結(jié)論，與本試驗(yàn)的結(jié)果相一致。

圖4 不同接觸介質(zhì)下牛肉中腸炎沙門氏菌的Fcc參數(shù)Fig.4 Fcc parameters of Salmonella enteritisin beef in different media

圖5為單一介質(zhì)及組合介質(zhì)牛肉中腸炎沙門氏菌的Fei參數(shù)。由圖5可知，單一介質(zhì)及組合介質(zhì)條件下，F(xiàn)ei參數(shù)值范圍為(17.63±6.75)%～(60.49±15.19)%，在單一介質(zhì)情況下的手套的Fei參數(shù)值與刀具、案板的參數(shù)值具有顯著差異性(P<0.05)。3種介質(zhì)都受到污染的Fei參數(shù)值最高，除了與手套接觸場(chǎng)景外，與其他設(shè)置場(chǎng)景都存在顯著差異性(P<0.05)。Luber等[26]進(jìn)行廚房雞肉準(zhǔn)備階段的交叉污染研究，發(fā)現(xiàn)雞腿與雞肉轉(zhuǎn)移到手部的轉(zhuǎn)移率分別為2.9%和3.8%，而受污染手部以及用具轉(zhuǎn)移到即食制品的轉(zhuǎn)移率為2.9%～27.5%，與本試驗(yàn)結(jié)果有所差異。本試驗(yàn)中牛肉中的沙門氏菌的轉(zhuǎn)移率范圍更為寬泛。這可能是因?yàn)榫N以及肉類產(chǎn)品的不同導(dǎo)致，同時(shí)由于廚房器具的組合也會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)移率的上升。

圖5 單一介質(zhì)及組合介質(zhì)牛肉中腸炎沙門氏菌的Fei參數(shù)Fig.5 Fei parameters of Salmonella enteritisin beef in different media

3 結(jié)論

本研究的結(jié)果可以完善快速定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具中廚房階段腸炎沙門氏菌典型組合的相關(guān)交叉污染參數(shù)，填補(bǔ)原本參數(shù)的空缺。在完善參數(shù)的過程中，也同時(shí)發(fā)現(xiàn)交叉污染是重要的路徑之一。生熟不分離以及不完全的清洗都可能導(dǎo)致交叉污染的發(fā)生，從而引起大面積的食源性致病菌爆發(fā)，而操作者的操作規(guī)范程度也很大程度上影響了細(xì)菌的轉(zhuǎn)移。至此，就交叉污染路徑而言，需要更多的食源性致病菌-食品組合對(duì)交叉污染參數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的完善，不同接菌量的食源性致病菌導(dǎo)致的交叉污染情況也需要考慮在內(nèi)。與此同時(shí)，為了更好地使用工具進(jìn)行半定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，各地區(qū)的烹飪方式以及消費(fèi)量的數(shù)據(jù)收集也是今后值得關(guān)注的重點(diǎn)。就半定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估整體而言，其余污染路徑參數(shù)的完善與收集也是需要進(jìn)一步研究的問題。