田明勝，王 穎，陳 波，厲曙光

(1.復(fù)旦大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，上海 200032；2.上海市食品藥品監(jiān)督管理局執(zhí)法總隊(duì)，上海 200233)

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)是一種廣泛存在于農(nóng)業(yè)和食品加工環(huán)境中的人畜共患病病原菌，可在低氧條件和冷藏溫度下生長(zhǎng)的特性使得其在環(huán)境、食品、加工廠內(nèi)和家庭冰箱內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存活[1-2]。進(jìn)食被單增李斯特菌污染食品可能導(dǎo)致的李斯特菌病是一種罕見但具有潛在致死性的疾病，主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多，死亡率達(dá)20%～30%[3]。李斯特菌病的高死亡率，特別是暴發(fā)情況下單增李斯特菌常出現(xiàn)在規(guī)模化加工食品中[4]，使得李斯特菌病的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)影響可能位居食源性疾病之首[5]。疾病監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示：?jiǎn)卧隼钏固鼐磕暝诿绹蠹s引發(fā)2 500例發(fā)病，2 300例住院和500例死亡[6]；評(píng)估結(jié)果顯示在美國熟肉制品造成李斯特菌病風(fēng)險(xiǎn)最大(1 600例/年)[7]。

2000—2009年我國文獻(xiàn)報(bào)道了92例李斯特菌病例(32例發(fā)生在上海)[8]，2011—2016年又合計(jì)報(bào)告253例侵襲性李斯特菌病例[2]。我國目前尚缺乏單增李斯特菌病的流行病學(xué)負(fù)擔(dān)報(bào)告，但即食肉制品污染單增李斯特菌的安全風(fēng)險(xiǎn)不容忽視[9]。上海市在2000年開始監(jiān)測(cè)肉制品中單增李斯特菌的污染，如何定量確定肉制品中單增李斯特菌污染水平一直是各方探索的焦點(diǎn)[10-11]，本研究中，筆者對(duì)2008—2013年上海市售肉制品中單增李斯特菌污染監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并采用蒙特卡羅抽樣方法模擬計(jì)算單增李斯特菌污染水平，以便為開展定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

按月或季度采集各類市售肉制品，按無菌采樣程序采樣后冷鏈運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，按確定檢測(cè)方法開展檢驗(yàn)，6年合計(jì)抽樣監(jiān)測(cè)2 075件畜禽肉及其制品。

1.2 檢測(cè)方法

根據(jù)文獻(xiàn)[12]中第一法：常規(guī)培養(yǎng)方法對(duì)2008—2010年市售肉制品中單增李斯特菌污染進(jìn)行定性檢測(cè)。

參考國際標(biāo)準(zhǔn)組織ISO 11290-2:1998[13]和美國細(xì)菌學(xué)分析手冊(cè)(BAM)中單增李斯特菌最可能污染數(shù)(MPN)檢測(cè)程序[14]形成實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)，對(duì)2011—2013年市售肉制品中單增李斯特菌污染進(jìn)行定量檢測(cè)。檢測(cè)過程如下：無菌操作剪取25 g樣品放于盛有225 mL緩沖蛋白胨水(BPW)的均質(zhì)袋中，快速拍打1～2 min至樣品完全混勻，用BPW進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-1、10-2和10-3這3個(gè)稀釋度樣品勻液各1 mL，分別接種于10 mL緩沖李斯特菌增菌肉湯中，每個(gè)稀釋度接種3管，合計(jì)9管。30 ℃培養(yǎng)48 h后，從變濁陽性培養(yǎng)管中取增菌液劃線接種于李斯特菌顯色平板，于37 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行鑒定；對(duì)單增李斯特菌陽性檢測(cè)結(jié)果查閱MPN表確定其污染值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

定量檢測(cè)結(jié)果采用“MPN/g”表示，定性檢測(cè)結(jié)果采用“檢出或未檢出(以25 g計(jì))”表示。按肉制品類別和采樣時(shí)間分別進(jìn)行匯總。采用IBM公司SPSS 20.0和Palisade公司@Risk7.5 for Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和定量擬合。

2 結(jié)果

2.1 不同種類肉制品中單增李斯特菌污染率和污染值

筆者合計(jì)對(duì)2008—2010年的1 130件市售畜禽肉制品中單增李斯特菌污染進(jìn)行了定性檢測(cè)，結(jié)果見表1。由表1可知，在87件生鮮畜禽肉和1件散裝即食肉制品中檢出單增李斯特菌；對(duì)2011—2013年的945件市售畜禽肉制品中單增李斯特菌污染進(jìn)行了定量檢測(cè)，結(jié)果在2件散裝即食肉制品和1件預(yù)包裝即食肉制品中定量檢出單增李斯特菌，3件陽性樣品定量檢測(cè)值分別為2.3、110和2.3 MPN/g。

表1 市售畜禽肉及其制品中單增李斯特菌污染情況

注：*指陽性數(shù)/總樣品數(shù)。

2.2 肉制品中單增李斯特菌污染定量化

MPN法檢測(cè)時(shí)預(yù)設(shè)食品中微生物污染符合泊松分布[15]，其污染值M可利用式(1)計(jì)算[16]。

M=-(2.303/V)lg(S/n)

(1)

式中：S為陰性樣品件數(shù)；n為檢測(cè)樣品件數(shù)；V為檢測(cè)取樣量。

表2顯示了假設(shè)單增李斯特菌污染符合泊松分布時(shí)各類肉制品中單增李斯特菌污染最可能值的計(jì)算結(jié)果。

表2 市售畜禽肉制品中單增李斯特菌污染情況(MPN/g)

注：*表示該類食品單增李斯特菌陰性，用縱向總體污染水平表示；**表示計(jì)算的陰性樣品中單增李斯特菌可能污染值。

2.3 肉制品中單增李斯特菌污染定量模擬

泊松對(duì)數(shù)正態(tài)分布(Poisson Lognormal Distribution，PLN)有時(shí)可較好地模擬食物中微生物濃度[15,17]，假設(shè)各類肉制品中單增李斯特菌污染符合對(duì)數(shù)正態(tài)分布[18]，該分布均值可由樣品中單增李斯特菌污染最可能值的對(duì)數(shù)均值計(jì)算獲得，其標(biāo)準(zhǔn)差預(yù)設(shè)分布可假設(shè)為均勻分布[Uniform(0,4)]，即肉制品中單增李斯特菌污染符合正態(tài)分布：Normal[log(MPN/g)，Uniform(0,4)]，依據(jù)“拔靴法抽樣原理”，可利用@Risk for Excel軟件執(zhí)行“蒙特卡羅抽樣”模擬計(jì)算肉制品中單增李斯特菌污染水平[19]。鑒于生鮮畜禽肉、散裝即食肉制品和預(yù)包裝即食肉制品中單增李斯特菌污染率有顯著差異(P<0.05)，使用@Risk7.5軟件進(jìn)行迭代抽樣100 000次模擬計(jì)算三類產(chǎn)品中單增李斯特菌污染水平(圖1～3)。

圖1 市售生鮮畜禽肉制品中單增李斯特菌 污染水平(log(MPN/g))Fig.1 Contamination distribution of Listeriamonocytogenes in raw meat products (log(MPN/g))

圖2 市售散裝即食畜禽肉制品中單增李斯特菌 污染水平(log(MPN/g))Fig.2 Contamination distribution of Listeriamonocytogenes in bulk deli-meats (log(MPN/g))

圖3 市售預(yù)包裝即食畜禽肉制品中單增李斯特菌 污染水平(log(MPN/g))Fig.3 Contamination distribution of Listeriamonocytogenes in prepackaged RTE meats (log(MPN/g))

2.4 各類肉制品中單增李斯特菌污染水平

定量模擬結(jié)果顯示市售生鮮畜禽肉制品、散裝即食肉制品和預(yù)包裝即食肉制品中單增李斯特菌污染符合泊松對(duì)數(shù)正態(tài)分布(-2.419，2.336)、(-3.735，2.325)和(-3.870，2.334)(log(MPN/g))。根據(jù)對(duì)數(shù)正態(tài)分布理論可計(jì)算樣品中單增李斯特菌污染達(dá)到3.0 MPN/g或0.3 MPN/g的概率(表3)，由表3可發(fā)現(xiàn)在市售畜禽肉制品的單增李斯特菌污染監(jiān)測(cè)中，增加檢測(cè)接種量可獲得更多陽性結(jié)果，增加取樣件數(shù)也可獲得更多陽性結(jié)果，據(jù)此改進(jìn)監(jiān)測(cè)方案可更好地評(píng)估市售畜禽肉制品中單增李斯特菌污染水平。

表3 上海市售肉制品中單增李斯特菌污染水平 (log(MPN/g))

注：*P1表示污染水平>3.0 MPN/g的概率；**P2表示污染水平>0.3 MPN/g的概率。

3 討論

通過抽樣監(jiān)測(cè)獲得病原微生物在食品中污染率和污染水平是開展食品微生物定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的基礎(chǔ)。國內(nèi)對(duì)致病微生物監(jiān)測(cè)結(jié)果分析主要集中于報(bào)告檢出率(陽性率)[20-21]或者對(duì)陽性檢測(cè)值計(jì)算其幾何均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差[22-23]，對(duì)于低于檢出限樣品中微生物污染水平的研究較少[24-25]。

2008—2013年上海市市售肉制品中單增李斯特菌污染結(jié)果顯示生鮮畜禽肉(11.28%)，散裝即食肉制品(0.35%)和預(yù)包裝即食肉制品(0.22%)中單增李斯特菌污染率與江蘇省[20]、廣東省[21]和北京市[22]等省市監(jiān)測(cè)結(jié)果一致。

結(jié)合“微生物污染分布理論”和“拔靴法抽樣原理”，筆者利用隨機(jī)抽樣軟件探索給出了確定食品中病原微生物污染水平的簡(jiǎn)單方法，該方法對(duì)“定性檢測(cè)(2008—2010年)、定量檢測(cè)(2011—2013年)和部分定量檢測(cè)(2008—2013年)結(jié)果”均可在分析陽性檢測(cè)結(jié)果比例基礎(chǔ)上計(jì)算食品中微生物最可能污染值(MPN)，并借助軟件“可視化”的模擬評(píng)估微生物在相應(yīng)食品中的污染水平。定量模擬結(jié)果顯示市售“散裝即食畜禽肉制品”和“預(yù)包裝即食畜禽肉制品”中單增李斯特菌污染水平低于“生鮮畜禽肉”，有101.316=20倍差異，此差異能基本反映上海市肉制品加工銷售中單增李斯特菌污染控制水平。

根據(jù)對(duì)數(shù)正態(tài)分布理論可計(jì)算各類肉制品中單增李斯特菌污染>3.0 MPN/g或>0.3 MPN/g的概率(表3)，鑒于即食熟肉制品污染單增李斯特菌導(dǎo)致消費(fèi)者罹患李斯特菌病的風(fēng)險(xiǎn)最高[5]，依據(jù)研究中單增李斯特菌模擬計(jì)算污染水平與檢測(cè)限的比較，建議在實(shí)際監(jiān)測(cè)工作中增加接種量，當(dāng)然增加抽樣件數(shù)也可獲得更多陽性監(jiān)測(cè)結(jié)果，從而為定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估奠定基礎(chǔ)[26]。

4 結(jié)論

研究表明上海市售即食肉制品中單增李斯特菌污染較嚴(yán)重。利用隨機(jī)抽樣軟件比較準(zhǔn)確地模擬了計(jì)算肉制品中單增李斯特菌污染水平，計(jì)算的定量污染水平可用于改進(jìn)肉制品單增李斯特菌污染監(jiān)測(cè)方案，并可為肉制品單增李斯特菌污染定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的開展奠定基礎(chǔ)。