蘇蔓 李茵 趙倩 胡光磊 王振雷 何路軍

反復輸血或輸注血小板的患者可產(chǎn)生血小板同種抗體，血小板同種抗體包括紅細胞抗原（ABH）抗體、人類血小板抗原（human platelet antigen，HPA）抗體和人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）抗體。同種抗體的產(chǎn)生是導致免疫性血小板輸注無效（platelet transfusion refractoriness，PTR）的原因。血小板表面僅表達HLA-I類抗原，未發(fā)現(xiàn)HLA-Ⅱ類抗原，HLA-I類抗原是重要的血小板相關抗原，同種免疫產(chǎn)生抗HLA-I類抗體是造成免疫性PTR的最常見因素（約占免疫因素的80%），占所有病因的11.7%[1]。血小板表面表達的HLA-I類抗原以HLA-A和HLA-B抗原為主，HLA-C抗原僅有少量表達。本研究采用聚合酶鏈反應-序列特異引物（PCR-SSP）和聚合酶鏈反應-直接測序分型（PCR-SBT）方法對1 935名石家莊地區(qū)單采血小板捐獻者HLA-I類基因A、B位點進行分型，并建立血小板捐獻者基因資料庫，分析捐獻者基因資料庫HLA-A、HLA-B基因及單體型分布特點，現(xiàn)將研究結果報告如下。

材料與方法

1 標本來源 石家莊地區(qū)無血緣關系固定單采（機采）血小板捐獻者1 935名，告知其試驗目的，其知情同意并自愿加入本地區(qū)血小板捐獻者基因資料庫，留取EDTA抗凝靜脈血5 mL/人。

2 DNA提取 采用TIANamp Blood DNA Kit血液基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，北京）進行DNA提取，PCR擴增前將濃度調整至（30～70） ng/μL。

3 HLA基因分型 HLA基因分型采用聚合酶鏈反應-序列特異引物（PCR-SSP）方法（TBG生物科技有限公司，臺灣）和聚合酶鏈反應-直接測序分型（PCRSBT）方法（北京諾詩康瀛基因技術股份有限公司，北京），利用Arlequin（V3.5.1.3）軟件進行HLA單倍型統(tǒng)計。

4 統(tǒng)計學處理 HLA-A、B位點基因頻率（Gene Frequency，GF）GF=C/2N，C：具有某抗原的個體數(shù)，N：調查樣本的群體總數(shù)。

5 血小板捐獻者基因資料庫最小規(guī)模評價 假設有95%的把握在捐獻者基因資料庫中檢測到該單體型，采用單體型頻率(HF)估算捐獻者基因資料庫規(guī)模，N= –1.301 0/lg(1-2HF+HF2)，其中N為血小板捐獻者基因資料庫所需的最少人數(shù)，HF為單體型頻率[2]。

6 石家莊地區(qū)單采血小板捐獻者CREG表型頻率統(tǒng)計按照CREG（cross-reactive Groups，交叉反應組）表，CREG基因頻率為其對應HLA-A、B抗原特異性表位基因頻率之和[3]。

7 石家莊地區(qū)單采血小板捐獻者CREG不配合概率 石家莊地區(qū)單采血小板捐獻者CREG不配合概率（P）：P=2xy(1-xy)，x和y為CREG基因頻率[3]。

結 果

1 石家莊地區(qū)單采血小板捐獻者HLA-I基因頻率分析1 935位無血緣關系的血小板捐獻者中共檢出HLA-A位點抗原特異性19種，其中頻率最高的前5位抗原依次為A2（0.313 4）、A11（0.158 4）、A24（0.157 9）、A30（0.068 7）、A33（0.061 0），見表1；檢出HLA-B 位點抗原特異性40種，頻率最高的前5位抗原依次為B13（0.118 1）、B61（0.086 3）、B51（0.078 8）、B62（0.071 1）、B46（0.064 6），見表2；觀察到HLA-A-B單體型355種，頻率大于0.01的共28種，其中頻率最高的為A2-B13（0.044 4）和A2-B62（0.029 5），見表3。

2 石家莊地區(qū)血小板捐獻者基因資料庫最小規(guī)模評價如果按照單體型頻率HF=0.01估算血小板捐獻者基因資料庫最少規(guī)模N=150人，石家莊地區(qū)單采血小板捐獻者中HF＞0.01的所有單體型頻率之和為0.481 2，即一個150人的捐獻者基因資料庫僅有48.12%的患者有95%的可能性找到至少1例HLA相合的供者；如果按照單體型頻率HF=0.001估算捐獻者基因資料庫規(guī)模N=1 500人，石家莊地區(qū)單采血小板捐獻者中HF＞0.001的所有單體型頻率之和為0.931 8，即一個1 500人的捐獻者基因資料庫有93.18%的患者有95%的可能性找到至少1例HLA相合的供者。

表1 石家莊地區(qū)血小板捐獻者HLA-A基因頻率（n=1 935）

表2 石家莊地區(qū)血小板捐獻者HLA- B基因頻率（n=1 935）

表3 石家莊地區(qū)血小板捐獻者常見HLA-A-B單體型頻率

3 石家莊地區(qū)單采血小板捐獻者CREG表型頻率及不配合概率 石家莊地區(qū)單采血小板捐獻者中HLA-A位點的1C、2C和HLA-B位點的5C、7C、12C基因頻率均較高，見表4。石家莊地區(qū)單采血小板捐獻者A-A抗原CREG表位1C與2C發(fā)生不配合的概率最高，達到0.300 2；B-B抗原CREG表位7C與5C發(fā)生不配合的概率最高，為0.308 7；Broad-CREG中4C與6C的不配合概率為0.451 1，見表5。

表4 石家莊地區(qū)血小板捐獻者HLA-A和B抗原CREGs基因頻率(n=1 935)

表5 石家莊地區(qū)血小板捐獻者CREG表位不配合概率

討 論

血小板輸注通常用于預防和治療患者血小板減少或血小板功能缺失引起的出血，是臨床上重要的支持療法[4]。PTR是指患者在接受連續(xù)2次足夠劑量的血小板輸注后，臨床出血未見改善，血小板計數(shù)沒有明顯增高，有時反而下降[5]。造成PTR的原因通常有以下3種：血小板本身質量、非免疫因素以及免疫因素。非免疫因素一般是指消耗性凝血、脾腫大、敗血癥等，免疫因素是指患者體內產(chǎn)生了血小板同種抗體[6]。HLA具有豐富的遺傳多態(tài)性且抗原性較強，有研究表明，反復輸注血小板的患者約有50%～70%可產(chǎn)生HLA抗體[7]，且抗體陽性率與患者輸血的次數(shù)成正比[8]。HLA抗體是引起免疫性PTR的主要原因，有研究報道引起免疫性PTR的抗體中，單獨的HLA抗體占80%～90%，HPA抗體約占5%～10%，HLA/HPA復合抗

體約占10%～15%[9]。任明等[10]對115例血小板抗體篩查陽性的反復輸血的血液病患者進行抗體特異性檢測發(fā)現(xiàn)抗HLA-I類抗體陽性率更是高達97. 39%。

按照《臨床輸血技術規(guī)范》要求，目前我國臨床單采血小板輸注僅需ABO同型即可輸注，尚未將HLA相合納入硬性要求。許多HLA抗原因分子結構相近，而可與某一抗體存在不同程度的交叉反應，這些抗原被稱為交叉反應組（CREG）。患者隨機輸注血小板制品會接受與其自身不同的HLA-A、B抗原免疫，不但會產(chǎn)生針對單特異性抗原表位的抗體，也會產(chǎn)生CREG抗體，CREG抗體的產(chǎn)生同樣是導致PTR的原因之一[3]。在HLA配合性輸注血小板供者選擇中，當找不到與受者HLA抗原完全一致的血小板供者時，可以根據(jù)HLA的交叉反應性來篩選供者[11]。有研究表明，除A級（HLA-A、B位點4個抗原均匹配）和Bu級（HLA-A、B位點4個抗原中3個抗原匹配，1個抗原未知或空缺）相合外，Bx級（HLA-A、B位點2～3個抗原匹配，其余為CREG抗原）相合的血小板也能達到較好的輸注效果，故了解本地區(qū)單采血小板捐獻者CREGs基因頻率及表位不配合率對供者的選擇和減少因CREG抗原免疫產(chǎn)生CREG抗體所導致的PTR具有重要意義。本研究計算了石家莊地區(qū)單采血小板捐獻者CREG表型頻率并推導出CREG表位的不配合概率，發(fā)現(xiàn)A-A抗原CREG表位的1C與2C、B-B抗原CREG表位的7C與5C以及Broad CREG的4C與6C的不配合概率均較高，在臨床血小板輸注時選擇供者以避免因CREG抗原免疫產(chǎn)生CREG抗體所導致的PTR中應予以關注。

如要有效避免免疫性PTR的發(fā)生則需進行血小板HLA同型輸注，對于臨床已經(jīng)出現(xiàn)PTR的患者，采取HLA同型輸注也可以明顯改善輸注效果，或者為已產(chǎn)生HLA抗體的患者通過血清學血小板特殊配血實驗篩選無該患者HLA抗體相應抗原交叉配型相合的單采血小板[12]。Moroff等[13]研究表明輸注HLA A級和Bu級相合的血小板效果優(yōu)于輸注僅交叉配型相合的血小板。要實現(xiàn)HLA同型輸注就需要建立一個本地化已知HLA型別的血小板捐獻者基因資料庫。一個血小板捐獻者基因資料庫究竟需要庫容多少才能滿足臨床需求？從理論上講，捐獻者基因資料庫庫容越大患者找到相合供者的概率越高，但無限增加庫容會導致建庫成本提高。HLA在人群中分布特征因人種、遺傳背景不同而不同，Takahashi研究認為理論上在日本一個5 000人的血小板捐獻者基因資料庫中80%的患者可以找到5個HLA完全相合的供者，而高加索人和北美人群如達到這一要求則可能分別需要18 000和25 000人的捐獻者基因資料庫[14]，因此血小板捐獻者基因資料庫的建立應根據(jù)當?shù)厝巳篐LA分布情況來確定建庫規(guī)模[15]。我們根據(jù)本研究實驗數(shù)據(jù)對石家莊地區(qū)血小板捐獻者基因資料庫最小規(guī)模評價后，認為如果庫容為150人，在石家莊地區(qū)一個150人的捐獻者基因資料庫中僅有48.12%的患者有95%的可能性找到至少1名HLA相合的供者；如果建庫規(guī)模擴大為1 500人，則有93.18%的患者有95%的可能性找到至少1名HLA相合的供者。因此，理論上我們目前1 935人的血小板捐獻者基因資料庫基本上可以滿足石家莊地區(qū)血小板輸注無效患者找到HLA相合供者的需求。但是結合血小板輸注ABO同型的要求，同時有10%左右的免疫性PTR由血小板特異性抗體（HPA）導致，戴宇東[16]的研究結果表明中國漢族人群單采血小板供者HPA分型單庫容600人的捐獻者基因資料庫可有75%患者有95%的可能性找到至少1名ABO和HPA-1～16系統(tǒng)完全相同的供者。如考慮ABO、HLA、HPA均相合，仍需適當增加庫容量，以滿足石家莊地區(qū)患者的需求。利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突