劉丹丹（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬漳州市中醫(yī)院 漳州 363000）

復(fù)方丹參方是傳統(tǒng)中醫(yī)中最為經(jīng)典、常用的活血化瘀、理氣止痛方劑，是心血管疾病治療常用藥物，由丹參、三七及冰片構(gòu)成[1]。近年來(lái)，關(guān)于復(fù)方丹參方的藥效和活性成分的研究越來(lái)越多，通常是以方中的丹參或者三七單個(gè)作為成分研究的對(duì)象，很少將兩者主要活性成分在同個(gè)指紋圖譜中體現(xiàn)。筆者基于既往研究，建立HPLC法于同一色譜條件下便捷、迅速檢測(cè)出復(fù)方丹參方內(nèi)丹參中4種主要活性成分，以期為該藥物的藥效和質(zhì)量評(píng)定提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 試藥及儀器

1.1 試藥：復(fù)方丹參片（廣州白云山制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z44023372，批號(hào)20180912）；對(duì)照品包括三七皂苷R1（含量95%）、人參皂苷 Rg1（含量 92%）、丹參酮 IIA（含量 99%）、丹酚酸B（含量94%），均用于含量測(cè)定。甲醇、乙腈為色譜純，磷酸、鹽酸作為分析純，水為怡寶純凈水。

1.2 儀器：選用美國(guó)安捷倫科技公司生產(chǎn)的Agilent 1100型高效液相色譜儀及配套色譜工作站；北京賽多利斯公司生產(chǎn)的MS205DU型電子天平（感量0.1 mg）；上海必能信公司生產(chǎn)的SB2200型超聲波清洗機(jī)（50 Hz）。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液制備：精密測(cè)定復(fù)方丹參片20片，研磨成粉末狀，精密稱取300 mg，置入錐形瓶，再稱取70%甲醇20 mL加入，然后超聲提取30 min，靜置變冷，稱總量，用70%甲醇補(bǔ)充減少的量，搖勻，再緩緩過(guò)濾，取續(xù)濾液，溶液需超過(guò)孔徑0.45 μm 濾膜，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備：分別精密量取丹酚酸B（60 μg/mL）、人參皂苷 Rg1（10.2 mg/mL）、三七皂苷 R1（1.05 mg/mL）及丹參酮ⅡA（40 μg/mL）為對(duì)照品，加甲醇制成混標(biāo)溶液和單標(biāo)溶液。

2.2 色譜條件：色譜柱為Waters Acquity UPLC C18；流動(dòng)相為0.02%磷酸（A）和含0.02%磷酸的80%乙腈（B）；梯度洗脫，柱溫控制在40℃；流速設(shè)為0.42 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為203 nm；流動(dòng)相梯度為 0～0.8 min，90%（A）～80%（B），4～10 min 75%（A）～25%（B），10 min95%（B）[2]。

2.3 流動(dòng)相及檢測(cè)波長(zhǎng)選擇：本項(xiàng)研究中，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，甲醇的短波長(zhǎng)度會(huì)吸收紫外線，這會(huì)影響皂苷的色譜峰測(cè)定。因此，甲醇不能用作流動(dòng)相。樣品中含有酚酸，所以在流動(dòng)相中加入酸溶液以避免酚酸類物質(zhì)水解，而甲酸或者乙酸在低波長(zhǎng)下會(huì)吸收紫外線，選定流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸梯度本研究中的洗脫。

通過(guò)對(duì)三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、丹酚酸B、丹參酮IIA的紫外線檢測(cè)，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1在203 nm低波長(zhǎng)處出峰；丹酚酸B在281 nm處最大吸收；丹參酮IIA于270 nm處最大吸收。

按照色譜條件測(cè)定樣品溶液內(nèi)的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、丹酚酸B、丹參酮IIA含量，顯示4種成分和相鄰成分分離度良好，如圖1。

2.4 方法考察

2.4.1 線性分析：吸取混合對(duì)照品溶液用0.45 μm孔徑的濾膜濾過(guò)，于本研究色譜條件下分別進(jìn)樣 1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、20 μL 及 40 μL，記錄色譜峰面積。橫坐標(biāo)為濃度（X），縱坐標(biāo)峰為面積（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，再行線性回歸分析，4種成分標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍以及相關(guān)系數(shù)[3]。見(jiàn)表1。

表1 復(fù)方丹參方中的4種活性成分的線性關(guān)系

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)：取復(fù)方丹參片按樣品制備法分別平行制備4份樣品溶液，依照既定實(shí)驗(yàn)色譜條件測(cè)定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、丹酚酸B、丹參酮IIA平均含量。見(jiàn)表2。

表2 HPLC檢測(cè)復(fù)方丹參方中4種活性成分的重復(fù)性

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取復(fù)方丹參片樣品溶液，按照本研究色譜條件，分別在 0、2、4、6、8 h 測(cè)定、記錄色譜圖，計(jì)算出丹酚酸 B、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1及丹參酮IIA的峰面積的RSD。結(jié)果顯示各成分含量依次是0.93%、0.33%、0.68%、0.93%、0.87%，該溶液在避光密閉容器中保存8 h內(nèi)的含量變化不大，相對(duì)穩(wěn)定。

2.4.4 精密度試驗(yàn)：取混合對(duì)照品制成高、中、低濃度質(zhì)控品，按“2.3”項(xiàng)下操作處理，每一濃度連續(xù)進(jìn)樣5次，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出含量，并算日內(nèi)精密度。見(jiàn)表3。

表3 UPLC檢測(cè)復(fù)方丹參方中4種活性成分的精密度

2.4.5 回收率實(shí)驗(yàn)：精密稱取復(fù)方丹參片0.5 g，置于50 mL量瓶，超聲振蕩，平行3組，精密加入高、中、低劑量三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、丹酚酸B及丹參酮ⅡA對(duì)照品，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算4種成分回收率。見(jiàn)表4。

表4 HPLC檢測(cè)復(fù)方丹參方中4種活性成分的回收結(jié)果

3 討論

中藥復(fù)方是由辨證論治后，選擇適當(dāng)、合理劑量的藥物，嚴(yán)格按照組成原則進(jìn)行配伍組合制成的組合藥劑。這種處方中所含有效活性成分多樣且復(fù)雜，準(zhǔn)確有效選擇控制指標(biāo)是研究難點(diǎn)。本研究基于《中國(guó)藥典》及研究文獻(xiàn)，丹參含有豐富水溶性成分與脂溶性成分，選擇水溶性成分中的丹酚酸B與脂溶性成分中的丹參酮IIA用作指示性指標(biāo)。三七的主要成分為皂苷，最終選取三七人參皂苷R1、人參皂苷Rg1作為指標(biāo)成分，選定的指標(biāo)成分不但有代表性，而且有著良好科學(xué)性和客觀性。

在相同波長(zhǎng)下檢測(cè)含發(fā)色團(tuán)與輔助色團(tuán)等4種活性成分，先要對(duì)本研究結(jié)果中的成分進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，具體表現(xiàn)為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1在203 nm低波長(zhǎng)處出峰，丹酚酸B在281 nm處最大吸收；丹參酮IIA于270 nm處最大吸收，這是因?yàn)榘l(fā)色團(tuán)與輔助色團(tuán)中的三種皂苷較少，單單在低波長(zhǎng)下可以檢測(cè)到，原因在于波長(zhǎng)203 nm處會(huì)有末端吸收，通過(guò)連續(xù)調(diào)整流動(dòng)相比例，使檢測(cè)活性成分吸收峰和末端吸收峰分離度高于1.5，最后以末端吸收203 nm作為色譜條件。同時(shí)，使用HPLC測(cè)定活性成分，并在10 min內(nèi)清晰顯示色譜圖，分析所需時(shí)間更少，分離度更高，可提高檢測(cè)效率，節(jié)省人力、物力[4-8]。其次，參考《中國(guó)藥典》等文獻(xiàn)，通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相比例，比較流動(dòng)相是0.02%磷酸水和含0.02%磷酸80%的甲醇-水、水-乙腈、醋酸水-乙腈時(shí)所得色譜圖，最終選擇乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行成分檢測(cè)。從本研究結(jié)果看，采用HPLC法測(cè)定復(fù)方丹參方中丹酚酸B、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1及丹參酮IIA濃度和峰面積均有良好線性關(guān)系（r＞0.97）；同時(shí)，丹酚酸 B、人參皂苷 Rg1、三七皂苷R1及丹參酮IIA的平均提取回收率分別是99.42%、96.99%、97.04%、97.13%，精密度RSD均＜3.0%，且有著良好重復(fù)性、穩(wěn)定性，能滿足測(cè)定要求。

綜上所述，對(duì)臨床廣泛應(yīng)用的復(fù)方丹參方劑內(nèi)4種常見(jiàn)活性成分進(jìn)行測(cè)定，是對(duì)藥物質(zhì)量控制和管理的拓展和補(bǔ)充。HPLC測(cè)定復(fù)方丹參方中的丹酚酸B、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1及丹參酮IIA等活性成分有重要價(jià)值，且有高精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性。