鄧國(guó)英， 楊淑鳳， 任 峰， 崔 明， 隋韶光*

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室，遼寧 大連 116044；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 遼寧 大連 116023； 3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)科，遼寧 大連 116023)

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)廣泛分布于土壤和水等環(huán)境中，也存在于健康人的皮膚粘膜及腔道中，目前是引起醫(yī)院感染的常見的機(jī)會(huì)性致病菌[1]，該細(xì)菌易通過(guò)基因組變異獲得耐藥性并通過(guò)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和重組進(jìn)行傳播[2]。在美國(guó)，臨床分離到的鮑曼不動(dòng)桿菌約45%為多重耐藥菌，在拉丁美洲和中東地區(qū)，則高達(dá)70%[3]。碳青霉烯類如亞胺培南曾經(jīng)是治療該菌感染的首選抗菌藥物，但是臨床分離株對(duì)此類藥物已經(jīng)失去敏感性，多個(gè)耐藥基因參與耐藥性的形成[4]。鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株對(duì)外界抵抗力強(qiáng)，容易在機(jī)體或無(wú)生命材料表面形成生物膜[5]，生物膜作為細(xì)菌重要的致病機(jī)制之一，可以幫助細(xì)菌抵抗外界壓力如抗菌藥物，并有利于耐藥性的傳遞。此外，在鏈球菌[6]、結(jié)核分枝桿菌[7]等致病菌的研究中，O-甘露糖蛋白在細(xì)菌耐藥中發(fā)揮重要作用，是重要的毒力因子。為了探討鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性與生物膜形成及O-甘露糖的關(guān)系，從大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院收集24株鮑曼不動(dòng)桿菌，用藥物敏感試驗(yàn)觀察這些菌株對(duì)常用抗菌藥物的敏感性，針對(duì)耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌，采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)檢測(cè)耐藥基因碳青霉烯酶基因OXA-23的有無(wú)，分析細(xì)菌耐藥性與生物膜形成的相關(guān)性，并探討耐藥性與O-甘露糖蛋白表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)臨床分離株均來(lái)自大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院住院病人的痰標(biāo)本。

1.1.2 培養(yǎng)基 哥倫比亞血平板及肉湯培養(yǎng)基，分別用于細(xì)菌的分離培養(yǎng)及增菌培養(yǎng)。

1.1.3 材料與儀器 細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀為梅里埃VITEK 2 Compact，抗菌藥物的E-test試紙條來(lái)自法國(guó)梅里埃生物公司，基因擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)Bio-RAD公司，DNA提取試劑盒、DNA Marker DL2000及PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，瓊脂糖為美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品， 瓊脂糖凝膠電泳儀來(lái)自大連捷邁科貿(mào)公司，結(jié)晶紫、刀豆蛋白凝集素A (Concanavalin A, Con A)、ProteoSilverTMPlus銀染試劑盒及ConA瓊脂糖層析柱購(gòu)自Sigma公司，高速冷凍離心機(jī)為日本日立公司生產(chǎn)。使用的質(zhì)譜儀器為基質(zhì)輔助激光飛行時(shí)間質(zhì)譜儀5800 MALDI-TOF/TOF，為AB SCIEX生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離培養(yǎng)、鑒定及藥物敏感試驗(yàn) 細(xì)菌培養(yǎng)嚴(yán)格按照無(wú)菌操作進(jìn)行，VITEK2 Compact分析儀作細(xì)菌種屬鑒定，質(zhì)控菌株為霍氏腸桿菌(ATCC700323)。VITEK 2 Compact 分析儀也用于氨芐西林/舒巴坦等12種抗菌藥物敏感試驗(yàn)，測(cè)定最小抑菌濃度值(minimal inhibitory concentration, MIC)。頭孢哌酮、米諾環(huán)素及替加環(huán)素藥物敏感試驗(yàn)則采用紙片擴(kuò)散法。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌(ATCC25922)和銅綠假單胞菌(ATCC27853)。

1.2.2 碳青霉烯酶OXA-23基因檢測(cè) 鮑曼不動(dòng)桿菌DNA提取按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，OXA-23基因擴(kuò)增所使用引物為F：5′-AAGCATGATGAGCGCAAAG-3′，R：5′-AAAAGGCCCATTTATCTCAAA-3′，OXA-58基因引物為F：5′- GGTTAGTTGGCCCCCTTAAAPCR-3′，R：5′-AGTTGAGCGAAAAGG-GGATT-3′，反應(yīng)體系50 μL，包括10 × Pfu PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP mixture 5 μL，PfuDNA聚合酶0.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板1 μL，滅菌ddH2O 36.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，共30個(gè)循環(huán)；延伸溫度為72 ℃，1個(gè)循環(huán)，時(shí)間15 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用含0.5 μL/mL溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物。

1.2.3 生物膜形成試驗(yàn) 培養(yǎng)鮑曼不動(dòng)桿菌至OD值為0.5，取200 μL培養(yǎng)物加入微孔板，培養(yǎng)8 h，PBS清洗3次，1%結(jié)晶紫染色30 min，雙蒸水清洗去除多余染液，乙醇洗脫，570 nm測(cè)定OD值，每組設(shè)3復(fù)孔，僅含有培養(yǎng)基孔為對(duì)照組。

1.2.4 O-甘露糖蛋白的獲得及確證 ①膜蛋白的提取及定量：離心收獲耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌及非耐藥菌，超聲碎菌后，再次離心，取上清，4 ℃ 100 000×g超速離心1 h，沉淀膜蛋白，Bradford法定量蛋白。②ConA瓊脂糖親和層析獲得O-甘露糖基化蛋白:用緩沖液(1mol/L NaCl, 5 mmol/L MgCl2,5 mmol/L MnCl2和 5 mmol/L CaCl2)沖洗ConA瓊脂糖層析柱，然后進(jìn)行層析柱的平衡。膜蛋白配成濃度為1 mg/mL，流經(jīng)層析柱。應(yīng)用平衡緩沖液沖洗。最后用200 mmol/L甘露糖苷洗脫目的蛋白，收獲洗脫液并濃縮。③O-甘露糖蛋白的確證和解析：將蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后，用1∶ 5 000的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的ConA(Sigma)室溫孵育16 h后，洗膜后化學(xué)發(fā)光顯色。同時(shí)電泳后的蛋白條帶銀染，切下質(zhì)譜分析，并使用在線甘露糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)NetOGlyc 4.0 Server進(jìn)行蛋白質(zhì)的糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮑曼不動(dòng)桿菌的樣本來(lái)源及臨床分布

本研究收集的24株鮑曼不動(dòng)桿菌均來(lái)自痰液的分離培養(yǎng)，其中21株來(lái)自重癥醫(yī)學(xué)科，其余3株分別來(lái)自神經(jīng)外科、兒科和腎內(nèi)科。標(biāo)本來(lái)源以重癥肺炎患者居多(16株)。

2.2 標(biāo)本分離株的藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

24株臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)15種抗菌藥物耐藥情況見表1。

表1 分離菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥率

從表1可以看出，24株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢他啶、頭孢曲松、慶大霉素及哌拉西林均耐藥，對(duì)亞胺培南的耐藥率為83.33%，替加環(huán)素耐藥率最低，為12.50%。

2.3 碳青霉烯酶基因OXA-23的檢測(cè)

針對(duì)20株耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌，檢測(cè)了碳青霉烯酶基因OXA-23。PCR結(jié)果顯示，13株檢測(cè)到OXA-23基因片段，基因片段長(zhǎng)度為1 066 bp(圖1)，檢出率為65%。

圖1 鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶 基因OXA-23 PCR結(jié)果Fig.1 PCR products of A. baumannii carbapenemase gene OXA-23M：DNA 分子標(biāo)記；1～13：PCR產(chǎn)物 20株耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌中，13株檢測(cè)到碳青霉烯酶基因OXA-23 M：DNA Marker；1-13：PCR products OXA-23 gene was detected in 13 of 20 carbapenem resistant A. baumannii strains

2.4 鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性與生物膜相關(guān)性

結(jié)晶紫染色法顯示，耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成能力比非耐藥菌更強(qiáng)(圖2)，這可能是因?yàn)榧?xì)菌形成生物膜后耐藥基因更容易傳遞，因而形成生物膜的菌株更易獲得耐藥性。

圖2 鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯耐藥性 與生物膜形成的相關(guān)性Fig.2 The correlation between carbapenem resistance and biofilm formation in A.baumannii *P<0.05

2.5 鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯耐藥性與O-甘露糖蛋白表達(dá)的關(guān)系及糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

親和層析獲得的蛋白經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜及ConA識(shí)別，耐藥菌株為5個(gè)條帶，非耐藥菌為4個(gè)條帶(圖3A)，電泳及銀染后，將蛋白條帶(圖3B)切除作質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示，5個(gè)蛋白分別為OmpA/MotB、A1S_ 2371、A1S_ 0556、A1S_ 3744和A1S_ 3626，其中非耐藥菌株缺少A1S_ 3626。糖基化位點(diǎn)位于Ser和Thr上，位點(diǎn)總數(shù)從7個(gè)到28個(gè)不等 (表2)。

圖3 親和層析洗脫液ConA結(jié)合試驗(yàn)(A)及銀染結(jié)果(B)Fig.3 The binding assay of ConA with elutes of affinity chromatography (A) and silver stain (B) a～e:檢測(cè)到的糖蛋白條帶 a-e:The detected protein bands

表2 鮑曼不動(dòng)桿菌O-甘露糖基化蛋白質(zhì)譜結(jié)果和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

Table 2 MS analysis of O-mannosylated proteins and prediction of glycosylated sites inA.baumannii

條帶序號(hào)質(zhì)譜結(jié)果蛋白名稱甘露糖基化位點(diǎn)位點(diǎn)總數(shù)aA1S_ 1193OmpA/MotB151Ser/152Ser/153Thr/161Thr/163Thr/320Thr/339Ser7bA1S_ 2371Putative uncharacterized protein23Ser/24Thr/25Thr/35Ser/51Ser/52Thr/62Thr/73Ser/74Thr/75Thr/89Ser/94Ser/95Thr/99Thr/102Thr/103Thr/104Thr/106Thr/108Ser/109Thr/111Thr/112Ser/117Thr/119Thr/122Ser/165Thr/188Thr27cA1S_ 0556Putative uncharacterized protein 4Ser/31Ser/53Thr/56Ser/238Ser/305Ser/306Thr7dA1S_ 3744Putative uncharacterized protein26Thr/37Thr/52Ser/55Ser/58Thr/76Thr/79Thr/80Thr/81Thr/87Thr/92Ser/95Ser/96Ser/98Thr/106Ser/108Thr/132Ser/139Thr/144Thr/157Thr20eA1S_ 3626Putative uncharacterized protein43Thr/55Ser/61Thr/65Ser/79Thr/86Thr/89Thr/94Thr/97Thr9

3 討 論

近年來(lái)，鮑曼不動(dòng)桿菌成為醫(yī)院重癥患者感染常見的致病菌，一方面是由于細(xì)菌對(duì)外界因素有較強(qiáng)的抵抗力，易于在醫(yī)院環(huán)境及醫(yī)療器械上存活，另一方面，由于該細(xì)菌耐藥菌株甚至多重耐藥菌株的感染迅速增多，給治療增加了難度[8]。

本研究從臨床分離24株鮑曼不動(dòng)桿菌，這些患者多為重癥肺炎，部分伴有其他慢性疾病。對(duì)這些臨床株進(jìn)行抗菌藥物敏感試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)耐藥嚴(yán)重(表1)。碳青霉烯類抗菌藥物屬于β-內(nèi)酰胺類，但是對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，曾經(jīng)是治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染的重要藥物，如今耐藥率不斷上升，藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果顯示耐藥率為83.33%。鑒于此，世界衛(wèi)生組織已經(jīng)將耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌列為嚴(yán)重威脅人類健康的細(xì)菌，借此提醒醫(yī)務(wù)工作者及患者防范該細(xì)菌[9]。OXA類碳青霉烯酶分為四個(gè)類別，分別是OXA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-58，是鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性最主要的原因[10]。 OXA-23介導(dǎo)的耐藥性最為多見，它由質(zhì)粒編碼，耐藥性可隨質(zhì)粒在細(xì)菌間擴(kuò)散[11]。用PCR方法在基因水平檢測(cè)OXA-23基因的有無(wú)，結(jié)果顯示在20株耐碳青霉烯菌中13株為陽(yáng)性，可見產(chǎn)生這一基因位于多數(shù)耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌的遺傳物質(zhì)上。生物膜形成是細(xì)菌致病機(jī)制之一，細(xì)菌通過(guò)這種“群體行為”抵抗外界的壓力，引起醫(yī)院感染的常見細(xì)菌如肺炎克雷伯菌等耐藥基因與生物膜有關(guān)[12]。鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株在病人體內(nèi)形成生物膜可能更有利于耐藥基因在菌株間傳遞，所以結(jié)晶紫染色法顯示耐藥菌株形成生物膜的能力更強(qiáng)。

蛋白O-甘露糖修飾研究主要見于真核細(xì)胞，近些年，包括分枝桿菌屬在內(nèi)的多個(gè)種屬細(xì)菌蛋白也存在O-甘露糖修飾[13]。O-甘露糖蛋白被認(rèn)為是細(xì)菌重要的毒力因子，將鮑曼不動(dòng)桿菌O-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶敲除，將大大減弱細(xì)菌形成生物膜的能力，提示蛋白連接的甘露糖在生物膜形成中的重要作用[14]。OmpA是目前已知的可增強(qiáng)細(xì)菌耐藥性的O-甘露糖蛋白[15]，在本研究中，耐藥菌株和非耐藥菌株O-甘露糖蛋白的區(qū)別主要體現(xiàn)在A1S_ 3626上，提示這一O-甘露糖基化蛋白可能在細(xì)菌耐藥及生物膜形成中有重要作用。O-甘露糖蛋白提高細(xì)菌耐藥性的機(jī)制還不是很清楚，已有的研究提示糖鏈可能在此功能上很重要[14]，通過(guò)糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，5種蛋白的糖基化位點(diǎn)共7～28個(gè)不等，下一步將對(duì)檢測(cè)到的5種糖蛋白的糖鏈進(jìn)行解析，進(jìn)一步探討包括A1S_3626在內(nèi)的O-甘露糖蛋白在耐藥性及生物膜形成中的作用。