周連玉， 焦 璐， 李逢勁

(青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008)

虎掌菌(Sarcodonaspratus)又名翹鱗肉齒菌，是一種比較名貴的野生食用菌，其研究多集中于人工栽培[1-2]、組成成分的提取[3-5]以及活性的測(cè)定[6]等方面。以菌絲體生物量或胞外多糖為指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)方法優(yōu)化液體培養(yǎng)虎掌菌發(fā)酵條件[7-8]。目前采用液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)菌絲體和一些代謝物，可以克服栽培蕈菌子實(shí)體時(shí)遇到的困難。 微量元素硒(Se)在人及動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮著許多生物學(xué)功能。硒的吸收利用與其化學(xué)形態(tài)有關(guān)，無(wú)機(jī)硒毒性較大且不利于吸收，而有機(jī)硒毒性較弱又利于吸收[9]。目前較多的生物可以將外源無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)換為有機(jī)硒，香菇、靈芝、灰樹(shù)花、雞腿菇等多種蕈菌都具有富硒能力，并且不同的蕈菌液體耐硒能力不同[10-13]。適宜的亞硒酸鈉濃度可以增加不同蕈菌菌株液體發(fā)酵的菌絲體干重和發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)成分以及提高生物活性[13-15]。 而有關(guān)虎掌菌液體富硒培養(yǎng)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。 本研究采用多個(gè)衡量指標(biāo)通過(guò)三因素四水平正交設(shè)計(jì)優(yōu)化虎掌菌富硒液體發(fā)酵工藝條件，進(jìn)而篩選最佳發(fā)酵條件；基于優(yōu)化的發(fā)酵條件，添加不同硒濃度，探討硒對(duì)虎掌菌液體培養(yǎng)液中生物組分的影響，為更好理解蕈菌富硒機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)，為生產(chǎn)合適的硒源提供一種思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 虎掌菌(Sarcodonaspratus)菌株HZ,由青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：用于純化菌株和固體培養(yǎng)；液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，蒸餾水 1 000 mL， pH 自然；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母浸膏15 g，KH2PO41.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 自然。

1.1.3 儀器與設(shè)備 立式壓力蒸汽滅菌鍋(LS-35HD型，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司)；生化培養(yǎng)箱(250B型，金壇市富華儀器有限公司)；超凈工作臺(tái)(CJ-1S型，天津市泰斯特儀器有限公司)；可見(jiàn)分光光度儀(V-5100型，金壇市富華儀器有限公司)；水浴恒溫振蕩器(SHA-C型，金壇市天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠)；離心機(jī)(TD5A型，湖南赫西儀器裝備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 虎掌菌固體富硒培養(yǎng) 分別制備含亞硒酸鈉濃度0(CK)、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L的PDA平板，使用打孔器將虎掌菌菌落打孔成4 mm直徑規(guī)格的菌塊，接入制備好的平板中央，每個(gè)濃度重復(fù)10個(gè)培養(yǎng)皿， 25 ℃培養(yǎng)，待菌絲萌發(fā)后，觀察菌絲生長(zhǎng)情況。

1.2.2 制備液體菌種 250 mL三角瓶中裝入100 mL培養(yǎng)液，取3塊直徑4 mm菌塊接到三角瓶中，25 ℃，130 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，所得發(fā)酵液即為液體菌種。

1.2.3 虎掌菌液體富硒條件的優(yōu)化及驗(yàn)證 選擇葡萄糖(A)、酵母浸膏(B)、KH2PO4(C)、Na2SeO3(D)為主要影響因素，每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平(表1)，通過(guò)正交試驗(yàn)確定9個(gè)試驗(yàn)組合(表2)，按5%接種量將液體菌種接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)6 d。以菌絲體干重、硒含量、還原糖、氨態(tài)氮、蛋白質(zhì)為衡量指標(biāo)，根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果選擇最優(yōu)發(fā)酵條件的組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

表1 富硒虎掌菌液體培養(yǎng)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4 不同濃度硒對(duì)虎掌菌液體培養(yǎng)的影響 結(jié)合上述試驗(yàn)結(jié)果，選擇最佳的發(fā)酵條件，分別配置含亞硒酸鈉濃度為0(CK)、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L的液體培養(yǎng)基，250 mL三角瓶中裝入95 mL的培養(yǎng)液，接入5 mL液體菌種，25 ℃培養(yǎng)6 d。

1.2.5 測(cè)定指標(biāo) ①菌絲體生物量：將發(fā)酵產(chǎn)物4 000 r/min離心10 min，分別收集菌絲體和發(fā)酵液。菌絲體于60 ℃烘干至恒重，電子分析天平稱重。②pH：pH測(cè)試儀測(cè)定發(fā)酵液的pH。③氨態(tài)氮：甲醛滴定法測(cè)定發(fā)酵液氨態(tài)氮含量[16]。④蛋白質(zhì)：考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定發(fā)酵液蛋白質(zhì)的含量。⑤還原糖：3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定發(fā)酵液還原糖的含量[16]。⑥總糖：蒽酮-硫酸法測(cè)定發(fā)酵液總糖的含量[16]。⑦硒含量：廣東東方縱橫檢測(cè)有限公司采用GB5009.93-2017氫化物原子熒光光譜法[17]測(cè)定發(fā)酵液和菌絲體的硒含量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各項(xiàng)指標(biāo)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行相關(guān)性分析或單因素方差分析(LSD，P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硒濃度對(duì)虎掌菌菌絲生長(zhǎng)的影響

由圖1可以看出，在固體培養(yǎng)基上不同濃度的亞硒酸鈉對(duì)虎掌菌菌絲生長(zhǎng)有一定的抑制作用，且隨著亞硒酸鈉濃度的增加，其抑制作用呈增強(qiáng)趨勢(shì)。

圖1 虎掌菌菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d菌落特征的正面視圖(A)和反面視圖(B)Fig.1 Upper surface (A) and underside (B) of the 10 day colony of S. aspratus cultured in PDA medium 從左至右亞硒酸鈉濃度依次為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L Sodium selenite concentrations from left to right are 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 mmol/L, respectively

2.2 虎掌菌液體富硒條件的優(yōu)化

采用四因素三水平的正交試驗(yàn)得到各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定值(表2)，并進(jìn)行極差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。以菌絲體干重為指標(biāo)，由表3可知，各因素影響效果大小為亞硒酸鈉>KH2PO4>葡萄糖>酵母浸膏，最佳組合為A3B2C3D2。以菌絲體硒含量為指標(biāo)，各因素影響效果大小為Na2SeO3>葡萄糖>酵母浸膏>KH2PO4，最佳組合為A1B3C3D3。以發(fā)酵液硒含量為衡量指標(biāo)，影響效果大小依次為酵母浸膏>Na2SeO3>KH2PO4>葡萄糖，最佳組合為A3B1C3D3。以蛋白質(zhì)含量為衡量指標(biāo)的影響效果大小依次為葡萄糖>KH2PO4>Na2SeO3>酵母浸膏，最佳組合為A1B3C3D3。以氨態(tài)氮含量為衡量指標(biāo)，影響效果大小依次為酵母浸膏>KH2PO4>葡萄糖>Na2SeO3，最佳組合為A1B3C3D3。以還原糖含量為衡量指標(biāo)的影響效果大小依次為葡萄糖>酵母浸膏>Na2SeO3>KH2PO4，最佳組合為A3B2C1D3。

表2 富硒虎掌菌正交試驗(yàn)

表3 正交試驗(yàn)極差分析

2.3 驗(yàn)證虎掌菌富硒發(fā)酵條件

以菌絲體干重、硒含量、還原糖、氨態(tài)氮、蛋白質(zhì)為衡量指標(biāo)，得到4種最優(yōu)組合的富硒發(fā)酵條件，進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表4。與CK處理相比，虎掌菌在4種優(yōu)化發(fā)酵條件下所獲得菌絲體生物量、氨態(tài)氮以及還原糖的含量均顯著性增多(P<0.05)，而蛋白質(zhì)的含量顯著性減少(P<0.05)，綜合各項(xiàng)指標(biāo)，以還原糖含量為指標(biāo)的發(fā)酵條件下產(chǎn)生的還原糖、氨態(tài)氮及菌絲體生物量均較高，所以確定最佳發(fā)酵條件為葡萄糖6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、酵母浸膏3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、KH2PO40.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、Na2SeO30.6 mmol/L。

2.4 不同硒濃度對(duì)虎掌菌液體培養(yǎng)生物組分的影響

2.4.1 不同硒濃度對(duì)虎掌菌液體培養(yǎng)菌絲體和pH的影響 不同硒濃度對(duì)虎掌菌液體培養(yǎng)菌絲體生物量和pH的影響見(jiàn)圖2。與CK相比較，0.1～0.3 mmol/L硒濃度下，pH值有所增高，而0.4～0.7 mmol/L硒濃度下，pH值有所降低。與CK相比較，0.2 mmol/L硒濃度培養(yǎng)情況下，菌絲體干重含量最高。

表4 富硒虎掌菌正交試驗(yàn)的驗(yàn)證結(jié)果

注：1：以菌絲體干重為指標(biāo)的優(yōu)化培養(yǎng)基配方：葡萄糖6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、酵母浸膏3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、KH2PO40.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、Na2SeO30.4 mmol/L； 2：以還原糖含量為指標(biāo)的優(yōu)化培養(yǎng)基配方：葡萄糖6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、酵母浸膏3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、KH2PO40.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、 Na2SeO30.6 mmol/L；3：以氨態(tài)氮、蛋白質(zhì)、發(fā)酵液硒含量為指標(biāo)的優(yōu)化培養(yǎng)基配方：葡萄糖6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、酵母浸膏1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、KH2PO40.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、 Na2SeO30.6 mmol/L；4：以菌絲體硒含量為指標(biāo)的優(yōu)化培養(yǎng)基配方：葡萄糖2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、酵母浸膏4.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、KH2PO40.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、 Na2SeO30.6 mmol/L。同列的小寫字母表示試驗(yàn)組之間所測(cè)指標(biāo)的顯著性差異(P<0.05)

2.4.2 不同硒濃度對(duì)虎掌菌液體培養(yǎng)還原糖和總糖的影響 從圖3可以看出，不同硒濃度對(duì)虎掌菌液體培養(yǎng)還原糖和總糖的影響，與CK相比較，加硒后發(fā)酵液中還原糖及總糖顯著增多(P<0.05)。在硒濃度為0.5 mmol/L時(shí)，還原糖和總糖含量達(dá)到最高值。

圖2 不同硒濃度對(duì)虎掌菌液體 培養(yǎng)菌絲體和pH的影響Fig.2 Effects of selenium concentration on mycelial and pH of S. aspratus in liquid culture小寫字母表示不同硒濃度之間虎掌菌液體培養(yǎng)菌絲體的顯著性差異(P<0.05) Non-matching lower case letters indicate a significant difference in mycelial of S. aspratusin liquid culture(P<0.05)

圖3 不同硒濃度對(duì)虎掌菌液體 培養(yǎng)還原糖和總糖的影響Fig.3 Effects of selenium concentration on reducing sugar and total sugar of S. aspratus in liquid culture小寫字母表示不同濃度之間虎掌菌液體培養(yǎng)還原糖的顯著性差異(P<0.05)，大寫字母表示不同濃度之間虎掌菌液體培養(yǎng)總糖的顯著性差異(P<0.05) Non-matching lower case letters indicate a significant difference in reducing sugar of S. aspratus in liquid culture(P<0.05)， Non-matching upper case letters indicate a significant difference in total sugar of S. aspratus in liquid culture(P<0.05)

2.4.3 不同硒濃度對(duì)虎掌菌液體培養(yǎng)氨態(tài)氮和可溶性蛋白質(zhì)的影響 不同硒濃度對(duì)虎掌菌液體培養(yǎng)氨態(tài)氮和可溶性蛋白質(zhì)的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。與CK相比較，不同硒濃度培養(yǎng)情況下氨態(tài)氮含量顯著增加(P<0.05)，當(dāng)硒濃度為0.5 mmol/L時(shí)氨態(tài)氮含量達(dá)到最高值。與CK相比較，硒濃度為0.3～0.4 mmol/L時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)含量顯著性增多，而其他硒濃度下，可溶性蛋白質(zhì)顯著下降(P<0.05)。

圖4 不同硒濃度對(duì)虎掌菌液體培養(yǎng) 氨態(tài)氮和可溶性蛋白質(zhì)的影響Fig.4 Effects of selenium concentration on ammonia nitrogen and soluble protein of S. aspratus in liquid culture 小寫字母表示不同濃度之間虎掌菌液體培養(yǎng)氨態(tài)氮的顯著性差異，大寫字母表示不同濃度之間虎掌菌液體培養(yǎng)可溶性蛋白質(zhì)的顯著性差異(P<0.05) Non-matching lower case letters indicate a significant difference in ammonia nitrogen of S. aspratus in liquid culture(P<0.05), Non-matching upper case letters indicate a significant difference in soluble protein of S. aspratus in liquid culture(P<0.05)

3 討 論

一些研究者通過(guò)添加不同濃度的硒源研究蕈菌菌絲在固體培養(yǎng)基上的耐受力。香菇Q12菌株菌絲在0～110 mg/L不同亞硒酸鈉的固體培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，0～30 mg/L菌絲生長(zhǎng)速度不斷增加，而大于30 mg/L后，菌絲生長(zhǎng)速度逐漸降低[18]。用含有不同濃度亞硒酸鈉(0、20、50、100、150、200、250、300 mg/kg)的固體培養(yǎng)基對(duì)灰樹(shù)花GF5菌株進(jìn)行培養(yǎng)，菌絲在含20～100 mg/kg平板上能正常萌發(fā)，其生長(zhǎng)速度明顯高于對(duì)照；150～200 mg/kg硒濃度抑制菌絲萌發(fā)和生長(zhǎng)速度[13]。本研究發(fā)現(xiàn)虎掌菌在不同亞硒酸鈉0、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L條件下，隨著硒濃度增加菌絲生長(zhǎng)的速度減慢(圖1)?？梢?jiàn)不同蕈菌對(duì)硒的耐受性不同。

蕈菌液體富硒培養(yǎng)產(chǎn)生的菌絲生物量、菌體含硒量等物質(zhì)與所選擇的培養(yǎng)基成分及含量有關(guān)。以大球蓋菇菌絲體生物量、總硒濃度、富硒率和有機(jī)化程度為指標(biāo)，選取葡萄糖、酵母浸粉和亞硒酸鈉進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)，對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化。極差分析結(jié)果表明各因素對(duì)大球蓋菇生物量和富硒的影響大小依次為亞硒酸鈉添加量>酵母浸粉>葡萄糖，最優(yōu)組合為葡萄糖20 g/L、酵母浸粉4 g/L、Na2SeO3·5H2O 20 mg/L[19]。以菌絲生物量、有機(jī)硒及富硒率為指標(biāo)，碳源、氮源、pH、維生素4 種因素對(duì)茶樹(shù)菇3個(gè)指標(biāo)的影響主次關(guān)系不一致，根據(jù)硒含量和富硒率確定最優(yōu)組合[20]。本研究結(jié)果表明，4個(gè)因素對(duì)不同指標(biāo)的影響也有差異，通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)得到最優(yōu)組合為葡萄糖 6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、酵母浸膏 3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、KH2PO40.1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))、Na2SeO30.6 mmol/L。不同蕈菌采用不同的衡量指標(biāo)得到的富硒液體優(yōu)化條件不同。

通過(guò)微生物富集硒后，菌絲體或發(fā)酵液的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值會(huì)發(fā)生變化。不同亞硒酸鈉濃度(0～300 mg/L)對(duì)金耳發(fā)酵液中游離氨基酸、蛋白質(zhì)、總糖和還原糖含量的作用也各異[14]，當(dāng)在10 mg/L濃度下蛋白質(zhì)含量最多，而游離氨基酸的含量為最低值；總糖和還原糖的的含量隨著Na2SeO3濃度的增加而逐漸增加，而菌絲生長(zhǎng)量反之下降。本研究為亞硒酸鈉濃度為0～0.7 mmol/L，在0.2 mmol/L濃度下菌絲體生物量最多，還原糖和總糖含量均為硒濃度為0.5 mmol/L時(shí)達(dá)到最高值；與CK相比較，不同硒濃度促進(jìn)氨態(tài)氮顯著增加(P<0.05)，當(dāng)硒濃度為0.3～0.4 mmol/L時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)含量顯著性增多(P<0.05)。不同菌株在一定硒濃度下富硒后能提高蕈菌代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因此可作為補(bǔ)硒營(yíng)養(yǎng)品。

本研究發(fā)現(xiàn)虎掌菌具有一定耐硒能力，以不同指標(biāo)得到不同的虎掌菌富硒發(fā)酵條件，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)得出虎掌菌富硒最優(yōu)條件，不同濃度的硒對(duì)虎掌菌液體培養(yǎng)液中的pH、菌絲體、還原糖、總糖、氨態(tài)氮和蛋白質(zhì)有一定的影響，而對(duì)虎掌菌液體培養(yǎng)菌絲體中生物組分或生物組分的生物活性的影響還有待進(jìn)一步研究。