江會鋒， 劉玉萬， 楊巧玉,2

(1.中國科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308；2.中國科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049)

二氧化碳的生物固定是地球生命圈賴于生存的根本。光合生物利用太陽能通過光合作用把CO2轉(zhuǎn)化為碳水化合物，為整個生命體系提供了物質(zhì)和能量基礎(chǔ)，每年能夠產(chǎn)生2 000多億噸的生物質(zhì)。目前已發(fā)現(xiàn)的天然生物固碳途徑有6條，分別為卡爾文循環(huán)、Wood-Ljungdahl途徑、3-羥基丙酸雙循環(huán)途徑、還原性(逆向)TCA循環(huán)途徑、二羧酸/4-羥基丁酸循環(huán)途徑和3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(huán)途徑，主要通過羧化酶或還原酶進(jìn)行生物固碳。然而自然界存在的固碳途徑中，其核心固碳羧化酶或還原酶存在催化速度慢、催化反應(yīng)復(fù)雜、嚴(yán)格厭氧等諸多問題，因此天然固碳途徑的改造優(yōu)化難度較大。隨著合成生物學(xué)的快速發(fā)展，新酶新途徑的設(shè)計水平顯著提升。新設(shè)計的生物固碳酶可以部分解決天然固碳酶存在的缺陷，使得人工生物固碳途徑效率顯著提升，具有廣闊的發(fā)展?jié)摿?，是?dāng)前合成生物學(xué)研究的熱點。未來通過新酶改造與優(yōu)化，進(jìn)一步提升人工生物固碳效率，將有望創(chuàng)造全新的人工生物固碳路線，革新地球碳循環(huán)模式。本文通過對比分析天然固碳途徑和人工固碳途徑中涉及的羧化酶和還原酶的酶學(xué)數(shù)據(jù)，探討了人工生物固碳研究的未來發(fā)展趨勢。

1 天然固碳途徑中的羧化酶和還原酶

卡爾文循環(huán)是自然界中最主要的生物固碳途徑，其核心是Rubisco羧化酶 (核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶)[1]。近年來，圍繞著卡爾文循環(huán)途徑改造優(yōu)化做了大量工作，主要包括定向進(jìn)化提高Rubisco酶的活性[2-4]、碳濃縮機制的人工設(shè)計[5-7]及異源表達(dá)卡爾文循環(huán)途徑[8]等。然而相比于其他羧化酶(表1)，Rubisco酶活性相對較弱[9]，而且空氣中廣泛存在的O2還會和CO2競爭該酶的活性中心發(fā)生氧化反應(yīng)，如在C3植物中氧化反應(yīng)占到Rubisco酶總催化反應(yīng)的20%～30%[10]，因此Rubisco酶人工改造設(shè)計難度較大。

表1 幾種重要羧化酶的動力學(xué)參數(shù)

注：“-”表示暫無相關(guān)數(shù)據(jù)

Wood-Ljungdahl途徑是自然界存在的六條固碳途徑中唯一基于還原酶的固碳路徑[22]。首先，CO2被甲酸脫氫酶還原為甲酸，甲酸再被ATP活化后與四氫葉酸結(jié)合生成甲?；臍淙~酸，然后發(fā)生連續(xù)多次還原反應(yīng)。還原后的甲基四氫葉酸在CO脫氫酶/乙酰輔酶A合成酶復(fù)合體催化下與另外一分子CO2和輔酶A生成乙酰輔酶A。該途徑的實質(zhì)是2個CO2分子(或者1個CO2分子和1個CO分子)合成一個乙酰輔酶A。該途徑需要嚴(yán)格的缺氧條件，對金屬離子(Mo或W、Co、 Ni、Fe)要求高，并且廣泛使用輔酶(四氫蝶呤和鈷胺素)[23]。至今，該途徑依然沒有實現(xiàn)完全的異源表達(dá)。

2 利用固碳羧化酶的人工途徑設(shè)計

自然界存在的五條羧化酶固碳途徑中，二羧酸/4-羥基丁酸循環(huán)的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性最高。因此近年來，多個基于羧化酶的人工固碳途徑設(shè)計，都是以高效的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶為主。Arren等[24]以自然界固碳效率最高的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶為基礎(chǔ)，計算獲得了非天然的合成固碳途徑——丙二輔酶A/草酰乙酸/乙醛酸途徑(MOG)(圖1)。Bouzon等[25]同樣利用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶實現(xiàn)了CO2轉(zhuǎn)化為甲醛，最后甲醛與四氫葉酸結(jié)合進(jìn)入中心代謝。

圖1 設(shè)計的丙二酰輔酶A-草酰乙酸-乙醛酸途徑(MOG途徑)[24]Fig.1 Designed malonyl-CoA-oxaloacetate-glyoxylate pathway(MOG pathway)[24]

James C. Liao團隊Yu等利用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，構(gòu)建了蘋果酰輔酶A-甘油酸途徑(MCG)[26](圖2a)，成功實現(xiàn)了1分子磷酸烯醇式丙酮酸固定1分子CO2生成2分子乙酰輔酶A。該途徑與卡爾文循環(huán)途徑結(jié)合后，僅需要Rubisco酶固定1.5個CO2，5.5個ATP就能夠生成1分子乙酰輔酶A(天然卡爾文循環(huán)Rubisco酶需固定3個CO2，7個ATP才生成1分子乙酰輔酶A)，不僅降低了Rubisco酶的催化負(fù)擔(dān)，還提高了能量效率。另外結(jié)合乙醇酸脫氫酶，蘋果酰輔酶A-甘油酸途徑還能夠減少光呼吸的碳損失，蘋果酰輔酶A-甘油酸途徑能夠理論實現(xiàn)光呼吸路徑的100%碳得率(圖2b)，對光合生物改造具有重要意義。

圖2 設(shè)計的蘋果酰輔酶A-甘油酸路徑(MCG)(a)[26]和結(jié)合乙醇酸脫氫酶的 MCG途徑(b)Fig.2 Designed malyl-CoA-glycerate pathway (MCG) (a)[26]and MCG pathway binding to glycolate dehydrogenase(b)

此外，Tobias J. Erb研究組Schwander等構(gòu)建了基于還原羧化酶的巴豆酰輔酶A/乙基丙二酰基輔酶A/羥基丁?；o酶A循環(huán)途徑[27](CETCH途徑)(圖3)，該途徑所用的丁烯酰輔酶A還原羧化酶，在物種Streptomycescoelicolor的動力學(xué)參數(shù)：Kcat=32.9/s， Kcat/Km=1 642.6 L·mmol-1·s-1。通過酶改造優(yōu)化后，CETCH途徑純蛋白酶體外固定CO2的效率為5 nmol·mg-1·min-1，能夠與天然的CBB循環(huán)固碳效率相當(dāng)。盡管體外實驗證明CETCH循環(huán)可以達(dá)到與卡爾文循環(huán)相當(dāng)?shù)墓烫妓俾剩荂ETCH循環(huán)產(chǎn)物乙醛酸的還原度較低，因此該循環(huán)與已有代謝途徑的結(jié)合相對較難[28]。

3 基于固碳還原酶的人工途徑設(shè)計

CO2可以通過甲酸脫氫酶逐步還原為甲酸、甲醛甚至甲醇。甲酸脫氫酶可以將CO2直接還原為甲酸。甲酸脫氫酶主要有兩類：一類是基于NADH的甲酸脫氫酶，一類是含有金屬的甲酸脫氫酶。用輔酶NADH的甲酸脫氫酶活性往往不高，但是最近報道的來源于Clostridiumljungdahlii的基于NADH的甲酸脫氫酶[29]，其活性較高，Kcat/Km可達(dá)39.2 L·mmol-1·s-1。金屬依賴的甲酸脫氫酶活性中心往往含有鉬或鎢，對氧敏感且需要輔酶，其活性要高于利用NADH輔酶的甲酸脫氫酶，如來源于Desulfovibriodesulfuricans的甲酸脫氫酶[30]，Kcat/Km可達(dá)2 968.2 L·mmol-1·s-1。甲酸屬于相對較強的酸(pKa=3.75)，往往以甲酸負(fù)離子的形式存在，自身縮合反應(yīng)可能性較低。雖然有報道稱在馬鈴薯塊莖中存在甲酸縮合為乙醛酸的反應(yīng)[31]，但是其真實性還需要進(jìn)一步驗證。甲醇也無法進(jìn)行直接縮合利用，通常被氧化甲醛或者甲酸進(jìn)入中心代謝[28]。因此自然界存在的甲酸或甲醇同化途徑大多都是轉(zhuǎn)化成了甲醛。

圖3 設(shè)計的巴豆酰輔酶A/乙基丙二酰輔酶A/羥基丁酰輔酶A循環(huán)(CETCH循環(huán))[27]Fig.3 Designed crotonyl-CoA/ethylmalonyl-CoA/hydroxybutyryl-CoA cycle(CETCH cycle)[27]

甲酸除了通過輔酶四氫葉酸還原為甲醛(亞甲基四氫葉酸)，還可以直接被還原為甲醛。存在于甲基營養(yǎng)菌的核酮糖單磷酸循環(huán)(RuMP途徑)能夠同化甲醛分子進(jìn)入中心代謝[35]，同化甲醛的關(guān)鍵酶6-磷酸己酮糖合成酶(HPS)對甲醛的親和性特別高，Km可達(dá)59 μmol/L，反應(yīng)速率也較高。Meyer等[36]通過不斷馴化，成功實現(xiàn)了甲醇為碳源的條件下，大腸埃希菌利用核酮糖單磷酸循環(huán)生長。另外結(jié)合核酮糖單磷酸循環(huán)和非氧化糖降解途徑，甲醇縮合循環(huán)(MCC)又被成功設(shè)計[37](圖5)，此途徑可將2分子甲醛和輔酶A轉(zhuǎn)化為1分子乙酰輔酶A，沒有碳損失且不需要ATP。但是此途徑中存在同一底物被兩個酶利用，且酶活性不同，容易造成整個系統(tǒng)不穩(wěn)定。

圖4 設(shè)計的修飾絲氨酸循環(huán)[34]Fig.4 Designed modified serine cycle[34]

圖5 設(shè)計的甲醇縮合循環(huán)(MCC)[37] Fig.5 Designed Methanol Condensation Cycle (MCC)[37]

除了改造優(yōu)化天然生物固碳途徑，全新人工設(shè)計的固碳利用途徑也取得了巨大成功。例如Siegel等通過新酶設(shè)計，成功地創(chuàng)建了催化甲醛聚合為1,3-二羥基丙酮的聚糖酶[38](圖6a)。此途徑具有路線短、化學(xué)驅(qū)動力大、對氧不敏感和與中心代謝無交叉等優(yōu)點。但是該途徑也存在聚糖酶的反應(yīng)活性較低，Kcat/Km為4.7 L·mmol-1·s-1；在較低甲醛濃度條件下主要產(chǎn)生羥基乙醛副產(chǎn)物等問題[39]。本課題組[40]前期基于化學(xué)合成原理，從頭設(shè)計了羥基乙醛合酶和乙酰磷酸合酶。結(jié)合磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶(PTA)，創(chuàng)建了一條從甲醛經(jīng)3步反應(yīng)合成乙酰輔酶A的非天然途徑(Synthetic Acetyl-CoA pathway，SACA途徑)(圖6b)，利用體外酶催化、體內(nèi)同位素標(biāo)記、細(xì)胞生長等實驗，證明了SACA途徑無論在體外還是體內(nèi)，都可以有效地將一碳轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A。乙酰輔酶A既是絕大多數(shù)生物制造產(chǎn)品的前體，又是細(xì)胞生命中能量與物質(zhì)代謝的樞紐，在生命代謝網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮舉足輕重的作用。不同于已知的自然生物途徑，從原料到乙酰輔酶A往往需要經(jīng)過8～10步以上的反應(yīng)，人工設(shè)計的SACA途徑只需要3步反應(yīng)。該途徑具有化學(xué)驅(qū)動力大、不需要能量輸入、與中心代謝正交和沒有碳損失等優(yōu)點，是迄今為止最短的乙酰輔酶A生物合成途徑。目前人工設(shè)計的SACA途徑中羥基乙醛合成酶活性還較低，Kcat/Km為9.6 L·mmol-1·s-1。進(jìn)一步酶改造優(yōu)化后，該途徑將具有巨大的應(yīng)用潛力。

圖6 設(shè)計的聚糖路線(a)[38]和設(shè)計的合成乙酰輔酶A路線(b)[40]Fig.6 Designed glycan route(a)[38] and Designed synthetic acetyl-CoA route(b)[40]

4 展 望

綜上所述，在深入解析自然已知固碳酶催化性質(zhì)和固碳途徑的代謝原理后，一方面可以利用自然進(jìn)化產(chǎn)生的這些高效固碳羧化酶或還原酶，通過代謝工程改造優(yōu)化，創(chuàng)建更高效的人工固碳酶和途徑；另一方面通過解析生物固碳酶的催化機理，然后利用新酶設(shè)計創(chuàng)建全新的人工固碳酶和固碳途徑，將有可能突破自然生物固碳途徑的各種條件限制，從而實現(xiàn)高效的人工生物固碳，建立全新的生物固碳模式。另外，自然生物固定CO2的能量主要來自于光合作用，然而自然光合作用的太陽能能量利用效率不到0.1%。相比而言，人工光伏發(fā)電已經(jīng)可以把太陽能的利用效率提高到20%左右。隨著光伏器件及電催化劑的發(fā)展，可以將太陽能產(chǎn)電與生物固碳相結(jié)合，創(chuàng)建高效的人工生物固碳元件和固碳途徑，突破自然固碳酶的局限，大幅提升CO2生物轉(zhuǎn)化利用效率，為以CO2原料的工業(yè)生物制造奠定基礎(chǔ)。