李柏謙 李鑒州 李海萍

廣州市從化區(qū)婦幼保健院兒科(廣州 510900)

人冠狀病毒OC43((human coronavirus OC43，HCoV-OC43))是冠狀病毒科的一種，是有包膜的單正鏈RNA病毒，在RNA病毒中具有最大的病毒基因組[1]。在人類中，冠狀病毒被證明可引起呼吸道感染，最常見的是上呼吸道感染，也可引起下呼吸道感染，也可以引起嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病，包括嚴(yán)重的急性呼吸道綜合癥(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)和中東呼吸綜合癥(Middle East Respiratory Syndrome，MERS)[2]。到目前為止，已經(jīng)鑒定出六種HCoV類型，包括OC43、229E，NL63，HKU1，SARS-CoV和MERS-CoV[3- 4]。HCoV-OC43和HCoV-229E是最早些年被發(fā)現(xiàn)，主要引起人類普通感冒，據(jù)報(bào)道，最近幾年又發(fā)現(xiàn)的NL63和HKU1引起輕度呼吸道感染，這四種冠狀病毒也可以引起嚴(yán)重的下呼吸道感染，在患有基礎(chǔ)疾病的幼兒或老年人中[5]。HCoV-NL63與急性喉氣管炎有關(guān)[6]。SARS-CoV是一種2bβ冠狀病毒，導(dǎo)致嚴(yán)重的下呼吸道感染，高發(fā)病率和死亡率[7]。新型冠狀病毒MERS-CoV，它是一系列高致病性、高死亡率(20%～40%)的下呼吸道感染的病原體，主要是中東地區(qū)的流行病，但在2014年又在韓國爆發(fā)[8]。冠狀病毒由于其重組，變異和感染多種物種和細(xì)胞類型的能力而可能引起高暴發(fā)，因此，它們具有在物種間跳躍的傾向[9- 10]。到目前為止，沒有針對冠狀病毒的抗病毒療法，只有少數(shù)選擇預(yù)防冠狀病毒的感染。因此對HCoV流行病學(xué)的監(jiān)測和了解HCoV流行病學(xué)特征，對于HCoV感染的預(yù)防和控制非常重要。我們收集2017年1月—2019年6月期間在從化地區(qū)婦幼保健院門診就診的有呼吸道感染癥狀的兒童610例，進(jìn)行咽喉和鼻拭子標(biāo)本采集，并觀察呼吸道感染的多種病毒的流行病學(xué)特征和冠狀病毒基因特點(diǎn)，對臨床早期診斷和合理用藥具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇病例為2017年1月—2019年6月就診于廣州市從化區(qū)婦幼保健院兒科門診，診斷為急性上呼吸道感染和下呼吸道感染的患兒，共610例, 其中男390例，女220例。年齡在6月—14歲之間，610例患兒按年齡分為：嬰幼兒組(6月～3歲)415例，兒童組(3歲～14歲)195例，共2個(gè)年齡組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有兒童或者父母得到書面知情同意書。

1.2 入組標(biāo)準(zhǔn)

樣本取自發(fā)熱≤4d(溫度≥37.5℃)且有鼻塞、流涕、咽痛、咳嗽、咳痰、喘息、呼吸困難和/或其他急性呼吸道感染癥狀的個(gè)體。經(jīng)臨床確診為上呼吸道感染(急性咽炎、急性鼻炎、急性扁桃體炎)，下呼吸道感染(急性支氣管炎、支氣管肺炎)，其中急性咽炎68例、急性鼻炎53例、急性扁桃體炎106例；急性支氣管炎268例、支氣管肺炎115例，診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》第8版[11]。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡小于6個(gè)月和大于15歲兒童；嚴(yán)重心臟病患者；肺炎感染引起的并發(fā)癥患者；嚴(yán)重精神疾病患者。

1.3 標(biāo)本收集

標(biāo)本采集與檢測用植絨鼻咽拭子從患者的鼻咽部取樣，將鼻咽拭子放入無菌儲存管中(含2mL生理鹽水)，立即送檢。采用直接免疫熒光法檢測：流感病毒A(IVA)、流感病毒B(IVB)、副流感病毒Ⅰ(PIVⅠ)、副流感病毒Ⅱ(PIVⅡ)、副流感病毒Ⅲ(PIVⅢ)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)，共7種呼吸道病毒抗原。采用熒光定量PCR方法，對HCoV-OC43病毒核酸進(jìn)行分析和測序，同時(shí)對冠狀病毒的亞型也進(jìn)行檢測，包括：HCoV-OC43，HCoV-229E， HCoV-NL63，HCoV-HKU1。

1.4 RT-PCR檢測冠狀病毒

按照試劑盒的說明操作，使用QIAamp MiniElute Virus Spin(德國QIAGEN)從200μL的喉嚨和鼻拭子樣本中提取病毒DNA和RNA。使用Thermo Scientific Revert Aid First絞鏈cDNA合成試劑盒(Thermo，USA)進(jìn)行病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄，過程為：25℃5min，42℃60min，然后70℃5min。cDNA可立即用于病毒檢測，或保存在-20℃下直至進(jìn)一步使用。通過標(biāo)準(zhǔn)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測冠狀病毒，篩選HCoV和4種(OC43、229E，NL63，HKU1)。TaqMan實(shí)時(shí)PCR引物和探針(由Invitrogen，Life Technology，上海合成)被設(shè)計(jì)為結(jié)合高度保守的HCoV區(qū)域和相應(yīng)物種，并通過Primer Express軟件(3.0版，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行分析(用于引物)。每個(gè)反應(yīng)混合物由10μL2×iQ Supermix反應(yīng)混合物(Bio-Rad)，2μL病毒cDNA，0.5μM正向和反向引物以及0.3μM探針和無核酸酶的水組成體積為20μL。對于總HCoV，實(shí)時(shí)PCR在95℃下進(jìn)行5min，然后在95℃下進(jìn)行45次循環(huán)15s，在60℃下進(jìn)行1min。對于物種229E / OC43/ NL63/ HKU1，在95℃下進(jìn)行5min實(shí)時(shí)PCR，然后在95℃下進(jìn)行45次循環(huán)15s，在55℃下進(jìn)行1min。然后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，分別是95℃持續(xù)30s，55℃15s，60℃45s。所有實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)均在ABI7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems)上進(jìn)行。用于反應(yīng)的引物如下，見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.5 HCoV-OC43 N基因的擴(kuò)增和測序

對于HCoV-OC43的N基因測序和系統(tǒng)發(fā)育分析，通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了3對引物，以結(jié)合相對保守的N基因區(qū)域。用于設(shè)計(jì)引物的參考序列包括GenBank數(shù)據(jù)庫中可用的來自不同地區(qū)和年份的15種代表性菌株。它們的GenBank登錄號為：NC_005147.1，AY585229.1，AY585228.1，KF530099.1，KF530098.1，KF530097.1，KF530096.1，KF530095.1，KF530093.1，KF530091.1，KP198611.1， KJ958218.1，JN129835.1，L14643.1和Z21849.1。引物是由中國上海的Invitrogen公司合成的。在準(zhǔn)備的20 μL反應(yīng)混合物中進(jìn)行PCR，該混合物包括10 μL 2×Premix Ex Taq(Takara，大連，中國)，2 μL模板cDNA，正向和反向引物各0.5 μmol。PCR程序?yàn)椋?5℃持續(xù)5 min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)：95℃持續(xù)30 s，50℃至55℃(有關(guān)不同引物的解鏈溫度，請參見表1)1 min和72℃ 1 min，最后在72℃延伸10 min。用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒(中國大連，Takara)純化用于測序的PCR產(chǎn)物，并將其克隆到PMD19-T載體(中國大連，Takara)中。用于克隆和測序的所有PCR產(chǎn)物均來自三個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)。測序由中國上海的Invitrogen公司進(jìn)行。用于測序的引物見表2。

表2 用于HCoV-OC43 N基因擴(kuò)增和測序的PCR引物

1.6 病毒檢測 選用美國 Chemieon公司產(chǎn)品，采用直接熒光免疫法，對流感病毒 A、B型(influenza virus,IVA、B)、副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 型 (parainfluenza virus, PIVⅠ、Ⅱ和Ⅲ)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)、腺病毒(adenovirus, ADV)共七種常見呼吸道病毒進(jìn)行檢測，通過奧林巴斯BX51熒光顯微鏡, 按試劑說明標(biāo)準(zhǔn)操作，觀察判斷結(jié)果 。

2 結(jié) 果

2.1 患者呼吸道感染病毒類型分布

參與觀察的610例患者中，其中男390例，女220例。嬰幼兒415(68.03%)例，平均年齡(2.15±0.27)歲，其中男嬰280例，女嬰135例。兒童195(31.97%)例，平均年齡(9.68±4.65)歲，其中男童110例，女童85例。各種常見病毒的發(fā)病情況，流感病毒A(IVA)111例(18.20%)、流感病毒B(IVB)61例(10.00%)、副流感病毒Ⅰ(PIVⅠ)42例(6.89%)、副流感病毒Ⅱ(PIVⅡ)34例(5.57%)、副流感病毒Ⅲ(PIVⅢ)77例(12.62%)、呼吸道合胞病毒(RSV)135例(22.14%)、腺病毒(ADV)82例(13.45%)，冠狀病毒(HCoV-OC43)68例(11.14%)。呼吸道感染多為流感病毒(A+B)和副流感病毒(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)共325例(53.28%)，其次是合胞病毒感染135例(22.14%)，腺病毒(ADV) 82例(13.45%)，冠狀病毒感染最低68例(11.14%)。見表3。

2.2 冠狀病毒HCoV各月份陽性率分布

統(tǒng)計(jì)2017—2019年總的HCoV的月份分布，可以看出，HCoV主要是在冬季和春季流行，但不同物種之間存在差異。HCoV-OC43全年均可檢出，春季(4月和5月)檢出率較高，冬季較低 。HCoV- 229E的流行高峰出現(xiàn)在2月，而其余月份的檢出率則要低得多。HCoV-NL63陽性率主要在夏季(7- 8月)和冬季(12月)檢出。HCoV-HKU1陽性率的高峰出現(xiàn)在1月至2月，不同月份的檢測率也存在差異。見表4。

2.3 冠狀病毒 HCoV核苷酸分析突變位置

我們在一些樣品中發(fā)現(xiàn)了核苷酸突變。N基因型的OC43冠狀病毒中有6個(gè)在N基因的25,059- 25,112核苷酸位置(參考菌株的Genbank登錄號：KF923904.1)中共有11個(gè)堿基的取代。發(fā)現(xiàn)基因型B的8種HKU1冠狀病毒中有6種在基因組的核苷酸位置24,465處有額外的插入，導(dǎo)致在Spike的氨基酸510位中有另外的氨基酸“蘇氨酸”插入(Genbank登錄號為DQ415911.1)。見表5。

表3 兒童呼吸道感染病毒類型的分布 例(%)

表4 兒童呼吸道感染的HCoV及其亞類月份的分布

表5 基因型N蛋白氨基酸位點(diǎn)突變分析

3 討 論

近年來，病毒研究的不斷進(jìn)步和發(fā)展, 發(fā)現(xiàn)致呼吸道疾病的病毒種類越來越多,需要用病原診斷作為治療依據(jù), 來指導(dǎo)呼吸系統(tǒng)感染性疾病的藥物選擇, 防止病毒對其他重要臟器的損害，合理用藥, 為避免濫用抗生素提供重要依據(jù)，具有重要的臨床意義。冠狀病毒(CoV)主要指人冠狀病毒(HCoV)是已知自然界中最長序列RNA病毒，能夠引起人類和動物呼吸道、消化道和神經(jīng)系統(tǒng)感染。20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)的HCoV-OC43和HCoV- 229E多引起普通感冒，而SARS-CoV 及MERS-CoV的暴發(fā)流行也引起人們對HCoV- OC43，229E，NL63和HKU1的再次關(guān)注。HCoV感染可見于成人、小年齡兒童及新生兒。HCoV- OC43，229E，NL63和HKU1臨床多表現(xiàn)為亞臨床感染和輕度呼吸道感染，但在兒童、老年人、免疫功能抑制等人群中可致重癥呼吸道感染。研究表明在呼吸道感染的住院患兒中這4 種HCoV- OC43，229E，NL63和HKU1呈全年散發(fā)，流行季節(jié)不明顯。國內(nèi)外研究顯示，在下呼吸道感染的住院患兒中HCoV的檢出率較低，占5.5%～7.9%，本研究中HCoV的檢出率也較低為11.14%。各種常見病毒的發(fā)病率，流感病毒A(IVA)111例(18.20%)、流感病毒B(IVB)61例(10.00%)、副流感病毒Ⅰ(PIVⅠ)42例(6.89%)、副流感病毒Ⅱ(PIVⅡ)34例(5.57%)、副流感病毒Ⅲ(PIVⅢ)77例(12.62%)、呼吸道合胞病毒(RSV)135例(22.14%)、腺病毒(ADV)82例(13.45%)，冠狀病毒(HCoV-OC43)68例(11.14%)。呼吸道感染多為流感病毒(A+B)和副流感病毒(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)共325例(53.28%)，其次是合胞病毒感染135例(22.14%)，腺病毒(ADV) 82例(13.45%)，冠狀病毒感染最低68例(11.14%)。

在SARS冠狀病毒爆發(fā)之前，冠狀病毒被認(rèn)為會引起人類輕度，自限性呼吸道感染[12]。但是SARS-CoV和MERS-CoV的出現(xiàn)改變了人們的認(rèn)識。 SARS-CoV的高致病性引起了對該病毒家族的新的關(guān)注，對SARS-和MERS-CoV起源的進(jìn)一步研究表明冠狀病毒變異的可能性以及從動物宿主到人類的傳播[13- 14]。因此，對人以及動物冠狀病毒的監(jiān)測對于HCoV變異研究和感染控制非常必要且重要[15]。然而，據(jù)我們所知，從化地區(qū)的HCoVs分子流行病學(xué)報(bào)道非常有限，關(guān)于HCoV的變異報(bào)告很少。因此，在這項(xiàng)研究中，我們調(diào)查了從化地區(qū)兒童急性呼吸道感染癥狀的HCoV的分子流行病學(xué)特征，并對HCoV最普遍的種OC43的N基因進(jìn)行了基因型分析，并觀察到新型OC43基因型N的流行情況。

我們在2017年1月—2019年6月，收集了610例急性呼吸道感染癥狀患者的咽喉和鼻拭子，檢測冠狀病毒和其他7種常見呼吸道病毒，RT-PCR方法用于HCoV檢測，以提高靈敏度并避免交叉污染和假陽性。與使用傳統(tǒng)PCR進(jìn)行HCoV篩查相比，RT- PCR方法靈敏度更高可能有助于HCoV的檢出率更高，并且可能是在HCoV監(jiān)測中更好的方法。但是，由于HCoV的檢出率在不同的地區(qū)和國家中有所不同，所以檢出率不同的另一個(gè)原因也可能在于區(qū)域分布。我們共檢測到4種HCoV物種，包括HCoV- 229E，OC43，NL63和HKU1，未檢測到SARS-CoV和MERS-CoV，說明從化地區(qū)高致病性SARS-CoV和MERS-CoV沒有傳播到本地。在本地流行的HCoV中，最常見的是OC43，其次是229E和NL63，而HKU1的檢出率最低。

我們發(fā)現(xiàn)從月度分布HCoV主要是在冬季和春季流行，但不同物種之間存在差異。HCoV-OC43全年均可檢出，春季(4月和5月)檢出率較高，冬季較低。HCoV- 229E的流行高峰出現(xiàn)在2月，而其余月份的檢出率則要低得多。HCoV-NL63陽性率主要在夏季(7～8月)和冬季(12月)檢出。HCoV-HKU1陽性率的高峰出現(xiàn)在1月至2月，不同月份的檢測率也存在差異。在已有的報(bào)道研究中可以發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，該研究有2年的數(shù)據(jù)[16]。因此，連續(xù)監(jiān)測的數(shù)據(jù)對于揭示HCoV流行病學(xué)的模式非常重要[17]。我們在一些樣品中發(fā)現(xiàn)了核苷酸突變。N基因型的OC43冠狀病毒中有6個(gè)在N基因的25,059- 25,112核苷酸位置中共有11個(gè)堿基的取代。發(fā)現(xiàn)基因型B的8種HKU1冠狀病毒中有6種在基因組的核苷酸位置24,465處有額外的插入，導(dǎo)致在Spike的氨基酸510位中有另外的氨基酸“蘇氨酸”插入。該地區(qū)冠狀病毒HCoV- 0C43具有很大的臨床多樣性，與國內(nèi)已發(fā)表的菌株HCoV- 0C43相比具有很高的同源性，同源性達(dá)97%～100%。

綜上所述，我們的結(jié)果表明，冠狀病毒OC43的檢出率與以前的報(bào)道相符，未發(fā)現(xiàn)新的傳染性冠狀病毒，冠狀病毒的流行趨勢穩(wěn)定，所有感染者均表現(xiàn)出輕到中度的呼吸道感染癥狀。HCoV-OC43春季(4月和5月)檢出率較高，冬季較低。由于本研究時(shí)間較短，陽性病例數(shù)較少，因此，需積累更多的資料，更好地了解其在兒童急性呼吸道感染中的作用。