黃耀星 嚴(yán)清青 蘇 偉 何梓健 羅鍵雄 李偉冬 趙寒冰 賈 林

廣州市第一人民醫(yī)院，華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院(廣州 510180)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP) 是一種嚴(yán)重的全身性疾病，腸道黏膜屏障損傷導(dǎo)致腸道細(xì)菌移位可造成對(duì)胰腺的“二次打擊”，誘發(fā)和加重全身炎癥反應(yīng)綜合征(systematic inflammation response syndrome, SIRS)、多器官功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，增加死亡風(fēng)險(xiǎn)[1]。以往由于檢測(cè)方法限制，對(duì)腸道生物屏障研究具有一定的局限性，16SrRNA高通量測(cè)序法靈敏度高，可較全面地檢測(cè)菌群的豐度、種類以及分布特點(diǎn)，有助于研究AP重癥化與腸道菌群失衡之間的關(guān)系。

保護(hù)腸道功能可改善SAP患者預(yù)后及縮短病程，但目前腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)、預(yù)防性使用抗生素、補(bǔ)充益生菌等治療手段仍存在爭(zhēng)議。祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)腸道功能障礙的認(rèn)識(shí)和研究歷史悠久，強(qiáng)調(diào)整體觀念、辯證施治，效果良好。課題組前期研究結(jié)果顯示[2]，血必凈注射液可抑制SAP大鼠炎癥介質(zhì)、二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸釋放，對(duì)腸黏膜損傷具有保護(hù)作用，然而對(duì)腸道菌群及生物屏障的作用和機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本研究通過建立急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠模型，闡述血必凈注射液對(duì)炎癥介質(zhì)、腸黏膜機(jī)械和生物屏障及菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑材料

SPF級(jí)成年SD大鼠(南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK(粵)2016- 0041)；血必凈注射液(天津紅日藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z2000403)；牛黃膽酸鈉(美國(guó)Sigma公司)；大鼠amylase、CRP、TNF-α、IL- 6、IL-1β、LPS、D-乳酸及DAO的ELISA試劑盒(Elabscience公司)；Trizol試劑盒(Invitrongen公司)；PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq II(TAKARA公司)；糞便細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(華大基因有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組和模型制備

40只SD大鼠按數(shù)字隨機(jī)法分為空白組(n=10)、假手術(shù)組(n=10)、ANP組(n=10)和治療組(n=10)，體質(zhì)量220～250 g。ANP組和治療組均采用經(jīng)膽胰管逆行注射4.5%牛黃膽酸鈉溶液(1 mg/kg)的方法制備ANP模型[3]，治療組造模3 h后經(jīng)鼠尾靜脈注射血必凈注射液(3 mL/kg)，ANP組則注射等量生理鹽水；假手術(shù)組僅翻動(dòng)胰腺、胃腸等器官后關(guān)腹。造模后24 h處死大鼠，收集結(jié)腸糞便、心臟采血、取回腸末段及胰腺組織。所有大鼠均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求進(jìn)行飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作。

1.3 血清淀粉酶、炎癥因子、D-乳酸及DAO的檢測(cè)

血液標(biāo)本經(jīng)低速離心后取上清，按酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒上說明，檢測(cè)血淀粉酶、CRP、TNF-α、IL- 6、IL-1β、LPS、D-乳酸及DAO的水平。

1.4 糞便樣本獲取與測(cè)序

大鼠麻醉后取仰臥位解剖，剪取結(jié)腸末端直至盲腸段，用滅菌鑷子將結(jié)腸段內(nèi)糞便取下(不少于3粒)，置于1.5 mL EP管中，凍存于- 80℃冰箱。大鼠糞便16SrRNA Illumina高通量測(cè)序送至華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)流程：DNA提取、設(shè)計(jì)合成、引物接頭、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化、PCR產(chǎn)品定量和均一化、Miseq文庫構(gòu)建、測(cè)序均按照試劑盒說明操作。根據(jù)各細(xì)菌的16SrRNA基因序列設(shè)計(jì)特異性PCR引物，采用RT-PCR方法檢測(cè)糞便乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、大腸桿菌、普拉梭菌的細(xì)菌數(shù)量。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)為物種多樣性指標(biāo)，Shannon指數(shù)越大Simpson指數(shù)越小，代表物種越豐富。

1.5 組織病理

4%多聚甲醛固定胰腺及回腸末段組織，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片后行HE染色，由兩位病理醫(yī)師閱片，胰腺病理評(píng)分采用Schemidt標(biāo)準(zhǔn)[4]，小腸組織病理評(píng)分采用Chiu’S分級(jí)[5]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

空白組大鼠體質(zhì)量(246.9±14.1)g，假手術(shù)組大鼠體質(zhì)量(248.4±12.2)g， ANP組大鼠體質(zhì)量(249.4±12.9)g，治療組大鼠體質(zhì)量(247.6±9.8)g，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？瞻捉M、假手術(shù)組造模24 h內(nèi)無死亡；ANP組大鼠腹脹、反應(yīng)遲鈍，造模24 h內(nèi)死亡2只；治療組大鼠有腹脹，反應(yīng)較遲鈍，多數(shù)排稀爛便，造模24 h內(nèi)死亡1只。

2.2 血淀粉酶、炎癥介質(zhì)、內(nèi)毒素水平

經(jīng)檢驗(yàn)CRP、TNF-平、LPS滿足方差齊性，采用單因素方差分析，AMS、IL- 6、IL-1差方差不齊，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；結(jié)果示ANP組和治療組血清AMS、CRP、LPS、TNF-α、IL- 6和IL-1β的水平高于空白組和假手術(shù)組(P<0.05)；血必凈治療組血清AMS、CRP、LPS、TNF-α、IL- 6和IL-1β水平低于ANP組(P<0.05)。見表1。

表1 各組的血清炎癥因子水平

圖1 各組糞菌α多樣性、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)

2.3 腸道菌群多樣性、豐度差異及菌群結(jié)構(gòu)的組成

糞便菌群經(jīng)16SrRNA高通量測(cè)序，見圖1 α多樣性分析、shannon指數(shù)和simpson指數(shù)所示，ANP組糞菌的豐富度和多樣性少于空白組和假手術(shù)組，血必凈治療組可改善ANP大鼠糞菌的豐富度和多樣性。圖2 β多樣性分析結(jié)果顯示，與空白組、假手術(shù)相比，ANP組糞菌群種類差異明顯，血必凈治療可縮小糞便菌群種類與空白組、假手術(shù)組的差異。圖3、4結(jié)果顯示，各組糞菌分類比較，ANP組厚壁菌門細(xì)菌量減少，血必凈治療可提高厚壁菌門菌量；Lefse結(jié)果顯示ANP組以變形菌門為主，治療組則以脫鐵桿菌為主。

圖2 各組糞菌β多樣性分析

圖3 各組糞便細(xì)菌門水平分布 圖4 Lefse分析

經(jīng)檢驗(yàn)各組糞菌數(shù)量滿足方差齊性，采用單因素方差分析；ANP組糞便中有益菌(乳酸桿菌、雙歧桿菌、普拉梭菌)數(shù)量低于空白組和假手術(shù)組，而致病菌(腸球菌、大腸埃希菌)增多；血必凈治療可提高ANP大鼠糞便有益菌數(shù)量，降低致病菌數(shù)量，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 各組大鼠糞便細(xì)菌量的比較

2.4 腸黏膜屏障功能及病理評(píng)分

經(jīng)檢驗(yàn)，各組數(shù)據(jù)均方差不齊，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；ANP組和治療組血清D-乳酸和DAO的水平高于空白組和假手術(shù)組(P<0.05)；血必凈治療組血清D-乳酸和DAO水平低于ANP組(P<0.05)。

空白組、假手術(shù)組胰腺組織無改變，ANP組胰腺組織炎癥有改變，治療組胰腺組織炎癥略輕于ANP組，病理評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示ANP大鼠建模成功；空白組和手術(shù)組小腸組織無改變，ANP組小腸黏膜結(jié)構(gòu)不完整，絨毛上皮水腫及局部脫落、潰瘍形成，固有層毛細(xì)血管及淋巴管擴(kuò)張，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；治療組病理改變介于空白組與ANP組之間，病理評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表3，圖5)。

表3 各組大鼠的腸黏膜屏障功能和組織病理評(píng)分

圖5 各組大鼠的小腸病理圖(HE染色法，50病)注：圖A：空白組，圖B：假手術(shù)組，圖C：ANP組，圖D：治療組

3 討 論

腸道屏障功能障礙在SAP中十分常見，是誘發(fā)和加重SIRS和MODS的關(guān)鍵，與疾病后期腸道細(xì)菌移位引起胰腺感染壞死，增加SAP患者死亡率息息相關(guān)[6]。腸黏膜屏障包括機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障及生物屏障，其損傷確切機(jī)制尚不明確。與機(jī)械、化學(xué)屏障相比，生物屏障受限于傳統(tǒng)檢測(cè)手段，以往研究報(bào)道更不多。隨著16SrRNA高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展，國(guó)內(nèi)外研究逐漸認(rèn)識(shí)到以腸道菌群為主的生物屏障在維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。

寄居在人類腸道內(nèi)的腸道菌群種類超過1 000種，數(shù)量高達(dá)100萬億，其中以專性厭氧菌為主，它們通過特異性抗原-抗體結(jié)合的方式定植于腸黏膜上皮表面并被粘液包裹形成菌膜，阻止條件致病菌作用于腸上皮細(xì)胞，能通過酵解作用為腸黏膜提供成分，促進(jìn)上皮修復(fù)，與宿主微空間結(jié)構(gòu)形成了一個(gè)相互依賴又相互作用的微生態(tài)系統(tǒng)[7- 8]。2015年Tan等研究發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，AP患者腸道菌群的多樣性明顯降低，腸道微生態(tài)失衡早在SIRS或MODS發(fā)生前已存在；對(duì)SAP患者的亞組分析顯示，腸道微生態(tài)失衡與MODS、二重感染發(fā)生密切相關(guān)，腸桿菌、腸球菌等有害菌數(shù)量與IL-1、IL- 6、TNF-α等炎癥因子水平呈正相關(guān)，腸道菌群的變化可導(dǎo)致腸屏障損害和誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)菌易位[9- 10]。2019年Zhu[11]等對(duì)AP患者和動(dòng)物模型研究報(bào)道，腸道菌群失衡與SIRS和腸黏膜屏障功能障礙顯著相關(guān)，移植AP糞菌的無菌小鼠較移植正常糞便對(duì)照組胰腺損傷更嚴(yán)重，證實(shí)腸道菌群失衡可影響AP重癥化，均提示腸道菌群失衡在AP發(fā)展中并不單純是“受害者”，反而更像是“扳機(jī)”在免疫炎癥反應(yīng)中起促發(fā)作用。

維持腸屏障功能的穩(wěn)定是SAP治療重點(diǎn)，在一定程度上能縮短病程及改善預(yù)后。然而包括預(yù)防性使用抗生素、腸道去污、早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)和補(bǔ)充益生菌等多種療法的效果仍存在爭(zhēng)議，Besselink發(fā)現(xiàn)預(yù)防性應(yīng)用益生菌反而增加SAP患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)[12]，糞菌移植技術(shù)(FMT)在AP臨床治療未有報(bào)道。祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)胰腺炎和腸道功能障礙的認(rèn)識(shí)和研究歷史悠久，認(rèn)為SAP病機(jī)是以瘀血熱毒互結(jié)為本。血必凈注射液是王今達(dá)教授以古方血府逐瘀為基礎(chǔ)精煉制成的中藥復(fù)方靜脈制劑，理論基礎(chǔ)是“菌(細(xì)菌)、毒(內(nèi)毒素)、炎(炎癥)并治”，其主要成分為赤芍、川芎、丹參、紅花、當(dāng)歸等[13]。血必凈注射液在膿毒血癥和SAP患者的臨床應(yīng)用中，具有拮抗細(xì)菌、下調(diào)內(nèi)毒素水平、調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)的合成與釋放、減少氧自由基總量、調(diào)節(jié)免疫功能、改善微循環(huán)、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞作用[14- 15]。

課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，血必凈注射液能降低ANP大鼠血清淀粉酶、TNF-α、內(nèi)毒素，下調(diào)腸黏膜Toll樣受體4和9的表達(dá)，抑制NF-κB的活性，下調(diào)促炎細(xì)胞因子的水平，降低DAO和D-乳酸水平，保護(hù)SAP大鼠腸黏膜屏障功能[2,16- 17]，但血必凈注射液對(duì)ANP腸道生物屏障和腸道菌群的影響尚未見報(bào)道。本研究中，從動(dòng)物模型胰腺和小腸組織的病理評(píng)分可知，ANP組大鼠腸道黏膜屏障發(fā)生嚴(yán)重的破壞，DAO和D-乳酸水平升高，血清內(nèi)毒素增加，16SrRNA高通量測(cè)序顯示糞菌的多樣性降低，與空白組、假手術(shù)的菌種種類差異明顯，厚壁菌門細(xì)菌明顯減少，說明ANP大鼠建模成功，存在明顯的腸黏膜屏障功能障礙。治療組給予血必凈注射液后，大鼠的小腸黏膜病理受損程度較ANP組減輕，血清內(nèi)毒素、DAO和D-乳酸水平降低，高通量測(cè)序顯示糞菌的多樣性較ANP組改善，菌種種類與空白組、假手術(shù)差距縮小，厚壁菌門細(xì)菌數(shù)量較ANP組提高；進(jìn)一步分析有益菌和致病菌的構(gòu)成發(fā)現(xiàn)，治療組乳酸桿菌、雙歧桿菌和普拉梭菌等有益菌數(shù)量顯著高于ANP組，腸球菌和大腸埃希菌等致病菌比例顯著低于ANP組。普拉梭菌屬于厚壁菌門梭菌綱，可以調(diào)控TNF-α等細(xì)胞因子分泌抗炎，其產(chǎn)物丁酸還可以為腸黏膜提供能量；雙歧桿菌和乳酸桿菌屬于大家熟知的厭氧益生菌群。而大腸埃希菌為主的需要條件致病菌優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，使得腸道厭氧菌生長(zhǎng)受抑，進(jìn)而引起SAP腸源性細(xì)菌感染已在實(shí)驗(yàn)中模擬證實(shí)[18]。

本研究ANP模型腸道菌群和黏膜屏障功能與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果相似，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)血必凈注射液可從微生態(tài)上增加ANP大鼠的腸道菌群多樣性和豐富性，增加益生菌的含量，降低有害菌群的定植能力，減少體內(nèi)內(nèi)毒素和促炎因子的水平，改善腸黏膜屏障功能，起到對(duì)腸道的保護(hù)作用。但腸道微生態(tài)門綱目科屬種的分類眾多，哪些細(xì)菌在腸道菌群失衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其代謝產(chǎn)物是否參與AP的進(jìn)展，仍需要進(jìn)一步更全面、深入的研究。