唐雨楠 馬爾妮

（北京林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

木質(zhì)素是自然界中唯一可提供芳環(huán)、含量僅次于纖維素的天然高聚物，全球每年生物合成新增量約為6×1014t[1]，具有來源廣泛、儲量豐富、資源可再生的特點。它包含芳香基、羥基、羰基、甲氧基、羧基、共軛雙鍵等活性官能團(tuán)，因而可以進(jìn)行羥甲基化、烷基化和去烷基化、酚化、?；?、酯化、氫解等多種反應(yīng)[2]，進(jìn)而有望實現(xiàn)在材料、化學(xué)、環(huán)境、能源等諸多領(lǐng)域的利用。近年來，在木材研究領(lǐng)域，人們應(yīng)用木質(zhì)素作為膠黏劑[3]，一些學(xué)者嘗試將木質(zhì)素作為木質(zhì)材料的改性劑。Gordobil等[4]以酯化木質(zhì)素浸注木材單板，提升其疏水性和疏油性。Zhou等[5]以工業(yè)堿木質(zhì)素浸注速生材，降低其吸水性、吸濕性，減小尺寸變形。然而相對于木材中的孔隙直徑，木質(zhì)素的粒徑較大，不利于深入木材內(nèi)部。為更好地滲透木材，增強(qiáng)改性效果，需要降解木質(zhì)素以減小粒徑，同時盡量保留活性官能團(tuán)。

在木質(zhì)素降解中，常見方法包括酸堿催化水解、醇解、氧化降解、還原降解和熱解等[6]。但這些方法所用能耗較大、污染較重，生物降解因其環(huán)境友好性而備受關(guān)注[7]。同時，生物降解具有底物專一、條件溫和、反應(yīng)效率高、易于控制等優(yōu)點。生物降解主要依靠微生物所分泌的酶。漆酶是三種經(jīng)典木質(zhì)素降解酶之一，以氧氣為最終電子受體，還原產(chǎn)物為水，是一種綠色環(huán)保的生物催化劑[8]。然而，漆酶氧化還原電勢較低，僅能降解木質(zhì)素中占10%～20%的酚類結(jié)構(gòu)單元[9-10]；另一方面，漆酶單一作用可能導(dǎo)致木質(zhì)素聚合[9,11-12]。

在漆酶/介體系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn)，在介體幫助下，漆酶可氧化占木質(zhì)素80%～90%的非酚類結(jié)構(gòu)單元。同時，介體可抑制木質(zhì)素的聚合作用，從而實現(xiàn)其全組分的顯著降解[13]。相較于合成介體，天然介體來源廣、成本低、毒性小、輔助漆酶催化效率高、不易使漆酶失活[14]。Yao等[15]研究表明：漆酶/天然介體系統(tǒng)可實現(xiàn)堿木質(zhì)素的高效降解和木質(zhì)素表面酚基的顯著富集。

本研究利用漆酶/香草醛天然介體系統(tǒng)處理工業(yè)堿木質(zhì)素，考察木質(zhì)素的粒徑和官能團(tuán)變化，在此基礎(chǔ)上探究漆酶/介體系統(tǒng)處理堿木質(zhì)素的優(yōu)化條件，為進(jìn)一步利用木質(zhì)素改性木材提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

漆酶（EC1.10.3.2，粉體），購于南京都萊生物技術(shù)有限公司；ABTS[2,2'-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽]，純度98%，購于上海麥克林生化科技有限公司；香草醛（C8H8O3）和1,4-二氧六環(huán)（C4H8O2），分析純，購于上海麥克林生化科技有限公司；工業(yè)堿木質(zhì)素，由常州山峰化工有限公司提供；檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙酸和乙酸鈉，分析純，購自北京化工廠。

1.2 設(shè)備

電子分析天平，AUX220，日本SHIMADZU公司；電熱恒溫水浴鍋，單列二孔DZKW-D-2，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；紫外-可見分光光度計,U-3900,日本Hitachi公司；多點磁力攪拌器，RO15，德國IKA公司；循環(huán)水真空泵，SHZ-III，上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，101-2AB，天津市泰斯特儀器有限公司；激光粒度分析儀，Mastersizer 2000，英國Malvern Panalytical公司；傅里葉變換紅外光譜儀,Nicolet 6700,美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 漆酶活性測定

本研究以常用的ABTS法測定漆酶活性[16-17]，參考國際酶學(xué)委員會（Enzyme Committee，EC）和其他相關(guān)研究的定義[17-18]，將最適條件（pH和溫度）下1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1μmol ABTS的酶量稱為漆酶的1 個酶活力單位U，即μmol/min；將每克漆酶所具有的酶活力定義為比酶活U/g。因此，測定所用漆酶的活性前，確定其最適條件，具體方法[18]如下：

分別配制1 mmol/L的ABTS溶液、0.000 2g/mL漆酶溶液和檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液。以1∶1∶3的體積比混合以上三者，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。以等體積蒸餾水替代漆酶溶液，作為對照樣品。置于水浴中反應(yīng)，冰浴結(jié)束反應(yīng)，使用分光光度計測定樣品在λ=420 nm處的吸光度。

首先，以緩沖液pH為自變量，在40 ℃下反應(yīng)5 min，選擇最適pH。然后，以反應(yīng)溫度為自變量，在pH=4 下反應(yīng)5 min，選擇最適溫度。最后，以ABTS溶液濃度為自變量，在最適pH和溫度下反應(yīng)30 min[18]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合定義可得所用漆酶的比酶活。計算公式[18]如下：

其中，反應(yīng)液中ABTS自由基濃度c根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合方程計算得出。

求得的比酶活數(shù)據(jù)用于木質(zhì)素處理中的酶量控制，同時便于比較研究。

1.3.2 堿木質(zhì)素處理

稱取一定質(zhì)量的漆酶于燒杯，按水:漆酶=100 mL:1g的比例加入去離子水[18]，磁力攪拌2 h。稱取一定質(zhì)量的干燥堿木質(zhì)素置于燒杯中。根據(jù)木質(zhì)素用量，按0.4%（w/w）、25 mL/g、1 mL/g的比例依次加入香草醛、乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、二氧六環(huán)。按對應(yīng)酶量[（U/g），即漆酶溶液濃度（U/mL）/反應(yīng)體系中木質(zhì)素濃度（g/mL）]加入漆酶溶液，開啟反應(yīng)。液面下方通空氣以提供漆酶所需氧氣，同時實現(xiàn)氣流攪拌，反應(yīng)一定時間。冰浴終止反應(yīng)，反應(yīng)液真空抽濾，濾渣置于60 ℃烘箱充分干燥，即得到LMS處理后的堿木質(zhì)素。

采用單一變量法研究時間、pH、溫度、酶量4 個因素對木質(zhì)素粒徑的影響，各因素的對應(yīng)水平見表1。其中LMS處理后的木質(zhì)素稱為處理組，其他操作一致、僅未添加漆酶得到的木質(zhì)素稱為對照組，未經(jīng)處理的木質(zhì)素為未處理組。

表1 各組木質(zhì)素的反應(yīng)條件 Tab.1 The reaction parameters of lignin in different groups

1.3.3 粒徑分析

使用激光粒度儀檢測LMS處理前后木質(zhì)素的粒徑。首先通過超聲使木質(zhì)素在水中充分分散，得到待測樣品；然后選擇分散劑和樣品的折光率分別為1.330 和1.530，控制樣品遮光率為10%～20%。之后檢測樣品在0.02～2 000 μm范圍內(nèi)的粒徑分布，同一樣品結(jié)果恒定后導(dǎo)出。

1.3.4 紅外光譜分析

使用紅外光譜儀檢測處理前后木質(zhì)素的官能團(tuán)。將適量樣品置于樣品臺的金剛石ATR附件上，選擇分辨率為4 cm-1，每個樣品在4 000～400 cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)掃描32 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 漆酶活性

試驗控制單一變量，分別得到樣品吸光度隨pH、溫度變化的曲線如圖1 所示。吸光度值越大，說明被轉(zhuǎn)化的ABTS量越多，即該因素水平下漆酶的活性越高。因此，分別選定漆酶的最適pH為4，最適溫度為40 ℃。

圖1 ABTS自由基的吸光度曲線Fig.1 The absorbance curves of ABTS radicals

在上述最適條件下實驗，繪制得到樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2 所示。其中線性擬合方程為：

式中：A——ABTS自由基吸光度；

c——ABTS自由基濃度，mmol/L。

R2=0.980 18，說明擬合程度良好。將最適條件下所得樣品的吸光度A=1.40 代入式（2）得到反應(yīng)液中ABTS自由基濃度，再將相關(guān)數(shù)據(jù)代入式（1），最終求得所用漆酶的比酶活為2 096.3 U/g。

圖2 ABTS自由基的吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of ABTS radicals

2.2 粒徑分析

對處理前后堿木質(zhì)素的粒徑大小及分布情況進(jìn)行分析，不同處理條件下堿木質(zhì)素的平均粒徑如圖3 所示。其中，未處理組和對照組的平均粒徑分別為5.821μm和9.312 μm。

圖3 不同處理條件下堿木質(zhì)素的粒徑Fig.3 The particle sizes of alkali lignin under different treatment parameters

由圖3 可知，LMS處理對木質(zhì)素粒徑的總體變化。整體而言，處理組樣品的平均粒徑全部小于對照組，80%小于未處理組；最小達(dá)到4.733 μm，比對照組木質(zhì)素的平均粒徑減小了49.17%，比未處理組減小了18.69%。該結(jié)果也在一定程度上說明LMS對木質(zhì)素具有降解作用，這與以往研究中的結(jié)論相一致[19]。

比較同一變量內(nèi)各梯度對應(yīng)木質(zhì)素的粒徑結(jié)果，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)時間為3 h、pH為3.5、溫度為35℃、酶量為3U/g的木質(zhì)素平均粒徑最小。由此將以上條件作為漆酶/香草醛介體系統(tǒng)處理堿木質(zhì)素的優(yōu)化參數(shù)。

考慮到時間、pH兩個變量下粒徑結(jié)果的組間差異較大，說明在本研究選定的梯度下，反應(yīng)時間和pH是堿木質(zhì)素粒徑降低程度的主要影響因素。

上述試驗結(jié)果表明：漆酶/香草醛介體系統(tǒng)處理可以減小木質(zhì)素的粒徑。然而，比較未處理組和對照組木質(zhì)素的平均粒徑，發(fā)現(xiàn)后者的平均粒徑反而增大。由此可見，僅介體處理可能造成木質(zhì)素的聚合，即LMS中漆酶以外的物質(zhì)可能導(dǎo)致木質(zhì)素出現(xiàn)團(tuán)聚。

通過圖4 中二者的粒徑分布情況，可以觀察到對照組雖然峰底寬與未處理組基本相等，但是相比于未處理組的峰高更低、偏度更大（負(fù)偏態(tài)）、峰度更小，說明LMS中漆酶之外的物質(zhì)或試驗方法使木質(zhì)素的粒徑分布的集中程度降低，木質(zhì)素以大顆粒為主。

出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象可能是因為：抽濾取濾渣的操作無法回收部分可溶于濾液的、降解程度較高的小粒徑木質(zhì)素；常規(guī)干燥過程中木質(zhì)素易出現(xiàn)氫鍵結(jié)合（類似于纖維角質(zhì)化[20-21]）；反應(yīng)體系中的介質(zhì)可能改變木質(zhì)素的表面性質(zhì)，使其彼此間易發(fā)生靜電吸引。

圖4 對照組與未處理組木質(zhì)素的粒徑分布比較Fig.4 Particle size distribution of control and untreated lignin

2.3 紅外光譜分析

為進(jìn)一步探討堿木質(zhì)素可能出現(xiàn)的化學(xué)結(jié)構(gòu)變化，采用紅外光譜對木質(zhì)素處理前后的官能團(tuán)變化進(jìn)行檢測。由于漆酶不會破壞堿木質(zhì)素的苯環(huán)結(jié)構(gòu)[18,22]，因此選擇代表苯環(huán)骨架振動的、吸收較為穩(wěn)定的1 508 cm-1處特征峰作為參照[18,23]，將其他波數(shù)下的透過率除以1 508 cm-1處的透過率，得到各處相對于參照峰的透過率并作圖。處理組最小粒徑木質(zhì)素與對照組、未處理組木質(zhì)素經(jīng)歸一化處理的紅外光譜結(jié)果如圖5 所示，堿木質(zhì)素紅外特征峰歸屬及三組木質(zhì)素的相對透過率見表2。

圖5 處理組最小粒徑木質(zhì)素與對照組、未處理組木質(zhì)素的紅外譜圖Fig.5 FT-IR spectra of lignin in treated, control and untreated groups

表2 堿木質(zhì)素的紅外特征峰歸屬及處理組最小粒徑木質(zhì)素與對照組、未處理組木質(zhì)素的相對透過率 Tab.2 The FT-IR absorption peak location and assignment of alkali lignin and relative transmittance in treated, control and untreated groups

整體而言，三組木質(zhì)素的紅外吸收譜線十分相似，說明處理前后木質(zhì)素的官能團(tuán)種類基本未發(fā)生變化，這與其他研究中的結(jié)果一致[24-25]。但部分峰的吸收強(qiáng)度有一定差異。在波數(shù)3 338 cm-1附近的吸收峰由O—H伸縮振動產(chǎn)生，該峰極寬且鈍，吸收較強(qiáng)，說明有較多的分子間或分子內(nèi)氫鍵形成。

相比于未處理組，處理組在2 935、2 846 cm-1處的透過率增加，說明—CH3、 —CH2—、—OCH3數(shù)量降低。對照組相對于未處理組的變化趨勢與處理組相對于未處理組的趨勢類似，但對照組在3 338、 2 935、 2 846 cm-1處透過率的增加更為顯著，即—OH、 —CH3、—CH2—、—OCH3數(shù)量的減少更為劇烈。因此，相較于僅介體處理，LMS處理可以更多地保留—OH、 —OCH3等活性官能團(tuán)。

3 結(jié)論

1）所用漆酶在pH=4、T=40℃的最適條件下與ABTS反應(yīng)，比酶活為2 096.3 U/g。采用漆酶/香草醛介體系統(tǒng)得到的堿木質(zhì)素最小平均粒徑為4.733 μm，與對照組相比降低49.17%。反應(yīng)中，時間、pH是主導(dǎo)因素。在本試驗條件下確定的優(yōu)化參數(shù)為反應(yīng)時間3 h、pH3.5、溫度35℃、酶量3U/g。漆酶/香草醛介體系統(tǒng)處理可減小木質(zhì)素粒徑，但是僅介體處理可能使木質(zhì)素發(fā)生團(tuán)聚。

2）漆酶/香草醛介體系統(tǒng)處理后，堿木質(zhì)素的官能團(tuán)種類未發(fā)生明顯改變，但是羥基、甲基、亞甲基、甲氧基等官能團(tuán)的數(shù)量出現(xiàn)變化，LMS處理比僅介體處理更能保留堿木質(zhì)素的活性官能團(tuán)。

木質(zhì)素粒徑減小有助于深入木材內(nèi)部，而保留活性官能團(tuán)有助于與木材實現(xiàn)良好的結(jié)合，該研究結(jié)論對于拓寬木質(zhì)素的應(yīng)用范圍，提高木質(zhì)素和速生材資源的利用率有一定的參考意義。