尹晶平，鄭東，張政，豐斌，祁松楠，唐琴晴，黃惠芳，邱駿(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床檢測中心，江蘇蘇州215006)

泌尿系統(tǒng)結(jié)石是泌尿外科常見的疾病之一，發(fā)病率及復(fù)發(fā)率高[1]，其中以磷酸鈣、磷酸銨鎂和草酸鈣結(jié)石為主。尿液內(nèi)磷酸鹽、草酸鹽等濃度增大時，晶體物質(zhì)即可析出沉淀形成尿路結(jié)石；高濃度的枸櫞酸及其鹽對泌尿系統(tǒng)結(jié)石的形成具有重要的抑制作用。因此，檢測尿液中草酸根、磷酸根及枸櫞酸根濃度，對研究及診斷泌尿系結(jié)石非常重要。目前，臨床上常用高效液相色譜法[2-3]、比色法[4-5]等對尿液中的草酸根、磷酸根、枸櫞酸根進(jìn)行測定，但高效液相色譜法使用的流動相復(fù)雜，對尿液中少量的蛋白質(zhì)需利用沉淀法去除且耗時較長；而比色法一般靈敏度較低、特異性和重復(fù)性較差?；诂F(xiàn)有檢測草酸根、磷酸根、枸櫞酸根的方法存在諸多不足，本研究建立一種離子交換色譜法對尿液中草酸根、磷酸根及枸櫞酸根進(jìn)行測定，并對其進(jìn)行性能評估，以期為尿路結(jié)石病的預(yù)防與治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要儀器與試劑 CIC-D120型離子色譜儀及SH-AC-11陰性色譜柱(柱尺寸：4. 6 mm×250 mm),SH IC-C18前處理小柱(規(guī)格：QTY50/2 mL，青島盛瀚公司)。濃鹽酸—樣品(CAS號：7647-01-0)購自無錫展望化工試劑公司；枸櫞酸標(biāo)準(zhǔn)品—標(biāo)準(zhǔn)樣品[批號：DL9Q-X3SX規(guī)格：30 mg(0.16 mmol)]、磷酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液—標(biāo)準(zhǔn)樣品[批號：GBW(E)083180；規(guī)格：1 000 mg/L(10.53 mmol/L)]、草酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液—標(biāo)準(zhǔn)樣品[批號：GBW(E)081605；規(guī)格：0.05 mol/L]均購自中國食品藥品研究院。

1.2方法 本研究中色譜系統(tǒng)使用梯度濃度的氫氧化鉀為流動相，流速為1 mL/min。性能驗證方法及標(biāo)準(zhǔn)均參照《中國藥典》(2015年版)通則中9012“生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則”[6]。

1.2.1檢出限 分別選取草酸根(5 mg/L)、磷酸根(10 mg/L)、枸櫞酸根(10 mg/L)樣本離子濃度進(jìn)行測定，進(jìn)樣體積25 μL，記錄色譜圖，計算最小檢測濃度Cmin，公式Cmin=(2HN×C×V)/25H，其中Cmin：最小檢測濃度，μg/mL；HN：基線噪音峰峰值，μS；C：標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，μg/mL；H：標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰高，μS；V：進(jìn)樣體積，μL。

1.2.2定量下限 將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋配制成0.2、0.5、1.0 mg/L 3個濃度樣本，每份樣本重復(fù)檢測5次，計算其變異系數(shù)(CV)及偏差(bias)，將同時滿足偏差≤15%、CV≤20%的最低濃度值作為定量下限。

1.2.3攜帶污染率(殘留) 先檢測高濃度樣本，校正為標(biāo)樣(100 mg/L)后，再檢測空白樣品計算殘留。首先計算出空白樣品和高濃度樣本的實測值，再計算空白樣品的實測值(A1表示)和定量下限樣本的實測值(A2表示)。攜帶污染率=(A1-A2)/A2×100%，以高濃度樣品之后在空白樣品中的攜帶污染率(殘留)不超過定量下限的20%為評價標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4線性評價 將100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水稀釋為7個濃度(草酸根為50、25、10、5、2.5、1、0.5 mg/L；磷酸根和枸櫞酸根為100、50、20、10、5、2、1 mg/L)，分別重復(fù)檢測3次，取均值。以各濃度的檢測偏差百分比<15%，且曲線的回歸系數(shù)(R2)>0.995判為呈線性。

1.2.5樣本保存劑(鹽酸)驗證 分別向1.93 mg/mL草酸根溶液加入1.0 mg/mL標(biāo)液，磷酸根溶液(濃度分別為79.8、15.76、24.54 mg/L)加入20.0 mg/mL標(biāo)液，枸櫞酸根溶液(11.72、14.72、6.72 mg/L)加入10.0 mg/mL標(biāo)液。分別加入6 mmol/L鹽酸30 mL、60 mmol/L鹽酸30 mL、60 mol/L鹽酸100 mL及濃鹽酸調(diào)pH<1等4個不同濃度的鹽酸保存樣本后，測定各樣本濃度，計算各組分的偏差，以偏差±20%之內(nèi)為評價合格標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.6精密度 分別對尿液中草酸根(1.41 mg/mL)、磷酸根(19.46 mg/mL)和枸櫞酸根(14.28 mg/mL)的3個加標(biāo)(草酸加標(biāo)濃度值分別為1、10、25 mg/L；磷酸和枸櫞酸加標(biāo)濃度值分別為2、20、50 mg/L)后樣本進(jìn)行連續(xù)檢測，每個濃度平行5份樣本，連續(xù)檢測3個批次，共計45份樣本。使用Excel 2010軟件計算檢測方法的精密度(以CV表示)。計算公式：CV批內(nèi)=SD批內(nèi)/批內(nèi)均值×100%，CV批間=SD批間/總均值×100%。

1.2.7回收率評價 分別對尿液中草酸根(1.41 mg/mL)、磷酸根(19.46 mg/mL)和枸櫞酸根(14.28 mg/mL)的3個加標(biāo)(草酸加標(biāo)濃度值分別為1、10、25 mg/L，磷酸根和枸櫞酸根加標(biāo)濃度值分別為2、20、50 mg/L)后樣本進(jìn)行連續(xù)檢測，每個濃度平行5份樣本，連續(xù)檢測3個批次，共計45份樣本?？鄢|(zhì)本底濃度后，計算各組分的加標(biāo)回收率，加標(biāo)回收率要求在80%～120%。

1.2.8樣本穩(wěn)定性 樣本加入保存劑后，置于4 ℃保存，分別在第1、2、3和4天共4個時間點進(jìn)樣分析，記錄每個時間點的檢測結(jié)果，平行進(jìn)行3組實驗。不同時間點各組分含量相對于初始檢測點含量的相對偏差應(yīng)≤5%，表明樣本穩(wěn)定；如果相對偏差超過15%，表明樣品已發(fā)生變化且影響最終定量結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1檢出限和定量下限 檢測標(biāo)準(zhǔn)草酸根溶液(5 mg/L)、標(biāo)準(zhǔn)磷酸根溶液(10 mg/L)、標(biāo)準(zhǔn)枸櫞酸根溶液(10 mg/L)的基線噪音均為92 μV；峰高分別為82 790 μV、80 086 μV、94 655 μV；檢出限分別為0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.02 mg/L。草酸根在0.5 mg/L時偏差為7.78%、CV為3.84%，磷酸根在1.0 mg/L時偏差為-3.17%、CV為8.15%；枸櫞酸根在1.0 mg/L時偏差為-7.50%、CV為4.94%；偏差及CV均滿足標(biāo)準(zhǔn)。故而草酸根定量下限為0.5 mg/L，磷酸根的定量下限為1.0 mg/L，枸櫞酸根的定量下限為1.0 mg/L(表1)。

表1 定量下限檢測結(jié)果

2.2攜帶污染率(殘留) 進(jìn)樣檢測尿液樣本時草酸根、磷酸根和枸櫞酸根分別在13.857 min、23.278 min和30.378 min處出峰(圖1A)，在進(jìn)樣100 mg/L濃度標(biāo)準(zhǔn)品后再接純水進(jìn)樣，由圖1B中可以明顯看出在13.857 min、23.278 min和30.378 min處基線平穩(wěn)，沒有出峰跡象，攜帶污染率符合要求，表明檢測方法不存在明顯的攜帶污染。

注：A，濃度100 mg/L草酸根離子、磷酸根離子和枸櫞酸根離子；B，純水。

2.3線性評價 檢測7個不同濃度樣本結(jié)果顯示，草酸根、磷酸根、枸櫞酸根分別在0.5～50 mg/L、1～100 mg/L、1～100 mg/L范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.995(表2)；各濃度點的偏差<15%(表3)。表明離子交換色譜法檢測草酸根、磷酸根、枸櫞酸根具有良好的線性關(guān)系。

表2 離子交換色譜法檢測3種離子的線性范圍

2.4樣本保存劑(鹽酸)驗證 加入4個不同濃度鹽酸保存樣本后檢測草酸根、磷酸根、枸櫞酸根濃度，結(jié)果表明在加入6 mmol/L鹽酸30 mL時，草酸根、磷酸根和枸櫞酸根偏差最小且均能達(dá)到要求，表明該濃度樣本保存劑符合臨床檢測要求(表4)。

表3 離子交換色譜法檢測草酸根的線性評價

表4 不同濃度樣本保存劑檢測結(jié)果

2.5精密度驗證結(jié)果 采用離子交換色譜法檢測草酸根、磷酸根和枸櫞酸根3個不同濃度的批內(nèi)CV和批間CV均在5%之內(nèi)(表5)，表明該方法具有良好的精密度。

表5 草酸根、磷酸根、枸櫞酸根精密度實驗結(jié)果

2.6回收率評價結(jié)果 分別對草酸根、磷酸根和枸櫞酸根3個濃度(草酸根加標(biāo)濃度值為1、10、25 mg/L，磷酸根和枸櫞酸根加標(biāo)濃度2、20、50 mg/L)的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗證。驗證結(jié)果證實，草酸根在3個濃度的加標(biāo)回收率為92.00%～101.56%，磷酸根在3個濃度的加標(biāo)回收率為100.10%～101.80%，枸櫞酸根在3個濃度的加標(biāo)回收率為97.16%～100.80%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性。見表6。

表6 回收實驗結(jié)果(mg/L)

2.7樣本穩(wěn)定性 通過保存不同時間的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4個濃度樣本在第1、2、3和4天相對0 d的相對偏差均≤15%(表7)。表明尿液中草酸根、磷酸根和枸櫞酸根在保存條件下保存4 d結(jié)果穩(wěn)定。

表7 草酸根、磷酸根和枸櫞酸根樣本穩(wěn)定性實驗結(jié)果

3 討論

研究表明，枸櫞酸根能通過有效減少尿液中鈣離子濃度，發(fā)揮其抑制草酸鈣結(jié)石形成的作用；泌尿系統(tǒng)結(jié)石患者低枸櫞酸尿癥的占比高達(dá)40.5%～63%[7]。一項對尿結(jié)石成分分析研究表明，尿結(jié)石患者中90.5%存在代謝異常，其中約64.5%為高草酸尿癥，其次是高鈣尿癥、低枸櫞酸尿癥等[8]。高草酸尿癥易發(fā)草酸鈣結(jié)石或草酸鈣/磷酸鈣等混合成分結(jié)石；同時低枸櫞酸尿癥易發(fā)草酸鈣、磷酸鈣結(jié)石。因此，檢測尿液中草酸根、磷酸根、枸櫞酸根的離子濃度對尿路結(jié)石的預(yù)防、診療具有重要作用。

目前，臨床上對于草酸根、磷酸根、枸櫞酸根等離子的檢測尚無便捷的方法。離子交換色譜法是利用被分離組分離子交換能力的差異或選擇性系數(shù)的差異而實現(xiàn)分離的方法。按照可交換離子所帶電荷符號的不同又可分為陽離子交換色譜法和陰離子交換色譜法。本研究選用陰離子交換色譜柱，其優(yōu)點是臨床上在留取尿液樣本時加入鹽酸酸化，可防止草酸濃度的變化，同時通過0.2 μm的微孔濾膜過濾和前處理小柱可以有效去除有機(jī)物和重金屬，以保護(hù)色譜柱。

本研究建立了離子色譜交換法檢測尿液中草酸根、磷酸根和枸櫞酸根的方法并進(jìn)行了系統(tǒng)的評價。結(jié)果表明，尿液中草酸根、磷酸根和枸櫞酸根攜帶污染率<5%，無明顯攜帶污染現(xiàn)象，因此不同濃度的樣品間不存在交叉污染，特別是高濃度樣本對后續(xù)的低濃度樣品檢測無影響。離子交換色譜法檢測草酸根、磷酸根和枸櫞酸根線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999，表明該方法具有良好的線性和較高的靈敏度，檢出限及定量下限均能滿足臨床需求。同時，該檢測方法的CV<5%，回收率為80%～120%，表明該檢測方法具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。尿液標(biāo)本4 ℃靜置4 d以內(nèi)相對于0 d的相對偏差均在±15%內(nèi)，可認(rèn)為尿液中草酸根、磷酸根離子和枸櫞酸根離子在4 ℃保存4 d是穩(wěn)定的，符合臨床檢測要求。本研究中不足的之處是沒有比較本方法定量檢測的草酸根、磷酸根與定量尿沉渣、人工鏡檢草酸根結(jié)晶、磷酸根結(jié)晶的相關(guān)性，有待于進(jìn)一步研究證實。