王雪亮，徐幸，魏萌，孔駿，肖艷群，周靖(上海市臨床檢驗(yàn)中心分子生物學(xué)室，上海200126)

磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α(phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase，PIK3CA)是Ⅰ類(lèi)磷脂酰肌醇-3-激酶p110α催化亞基的編碼基因。作為PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵組成部分，PIK3CA基因突變會(huì)導(dǎo)致腫瘤患者對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體等靶向藥物耐藥，從而使得治療效果不佳[1-2]。因此，治療前準(zhǔn)確了解PIK3CA突變狀態(tài)，對(duì)指導(dǎo)腫瘤患者用藥并降低治療風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

當(dāng)前臨床上PIK3CA突變檢測(cè)常用方法有擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，ARMS)、Sanger測(cè)序、高通量測(cè)序(next-generation sequencing，NGS)等。除了方法學(xué)眾多外，還有較多的實(shí)驗(yàn)室自建方法，不同方法檢測(cè)結(jié)果可能存在差異。先前研究表明，實(shí)驗(yàn)室間分子病理檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果一致性較差[3-5]，但目前尚未見(jiàn)PIK3CA突變檢測(cè)能力評(píng)估的報(bào)道。因此，本研究擬開(kāi)展PIK3CA基因突變檢測(cè)的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)，以期發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室相關(guān)項(xiàng)目存在的問(wèn)題，進(jìn)一步改善和提高其檢測(cè)質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1樣本 室間質(zhì)評(píng)樣本購(gòu)自菁良基因科技(深圳)公司，其通過(guò)基因編輯或者細(xì)胞篩選方法得到具有明確PIK3CA突變(H1047R、E545K、E542K)的細(xì)胞及野生型細(xì)胞，而后經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE)制備而成。FFPE樣本經(jīng)微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)，突變型樣本的突變比例約為50%。每支樣本管中放置1卷蠟片，組織厚度為15～20 μm，置于2～8 ℃保存。

1.2主要儀器與試劑 ABI 7500熒光定量PCR儀、NanoDrop One超微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；Centrifuge 5424R高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)。人類(lèi)PIK3CA基因突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)、FFPE DNA核酸提取試劑(廈門(mén)艾德生物醫(yī)藥科技公司)。

1.3室間質(zhì)評(píng)樣本的分析

1.3.1樣本DNA提取與檢測(cè) 取不同PIK3CA基因型FFPE樣本，使用FFPE DNA核酸提取試劑提取DNA，純化的DNA用NanoDrop One超微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。將測(cè)定的DNA濃度稀釋至2.0 ng/μL，按照PIK3CA基因突變?cè)噭┖屑癆BI 7500熒光定量PCR儀說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證不同PIK3CA樣本是否與預(yù)期基因型相符。

1.3.2均勻性評(píng)價(jià) 參照CNAS-GL003:2018《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》[6]中關(guān)于均勻性的評(píng)價(jià)要求，每批室間質(zhì)評(píng)樣本隨機(jī)抽取10支，采用PIK3CA基因突變?cè)噭┖袡z測(cè)，每支測(cè)定1次。

1.3.3穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 在參評(píng)實(shí)驗(yàn)室上報(bào)結(jié)果后3 d，隨機(jī)抽取2～8 ℃保存的各基因型室間質(zhì)評(píng)樣本6支，采用PIK3CA基因突變?cè)噭┖袡z測(cè)，每支測(cè)定1次，以評(píng)估其同步穩(wěn)定性。

1.4室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的實(shí)施

1.4.1方案設(shè)計(jì) 2018年和2019年室間質(zhì)評(píng)樣本盤(pán)包括5支樣本，其中突變型樣本3～4支，野生型樣本1～2支。為防止參評(píng)實(shí)驗(yàn)室串通數(shù)據(jù)，每套樣本盤(pán)的樣本進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)。

1.4.2組織形式 本項(xiàng)目室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)為自愿參加，上海市臨床檢驗(yàn)中心作為CNAS認(rèn)可的能力驗(yàn)證提供者，樣本盤(pán)經(jīng)冷鏈運(yùn)輸至各參評(píng)實(shí)驗(yàn)室，不指定檢測(cè)方法，要求其在規(guī)定時(shí)間內(nèi)(自樣本接收2周內(nèi))用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)，結(jié)果通過(guò)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)上報(bào)。

1.4.3結(jié)果評(píng)價(jià) 依據(jù)回報(bào)結(jié)果，按以下原則進(jìn)行判定：野生型樣本不能檢出突變型，突變型樣本不能檢出野生型或其他突變型。參評(píng)實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)評(píng)成績(jī)=符合的樣本數(shù)/總樣本數(shù)×100，100分為成績(jī)優(yōu)秀，80～99分為成績(jī)合格，小于80分為不合格。同時(shí)，計(jì)算各樣本的整體符合率、假陽(yáng)性率和假陰性率。

2 結(jié)果

2.1室間質(zhì)評(píng)樣本驗(yàn)證 對(duì)不同基因型FFPE樣本進(jìn)行核酸抽提，經(jīng)分光光度法測(cè)得H1047R、E545K、E542K和野生型基因組DNA平均含量分別為905.7 ng、977.2 ng、829.8 ng和784.3 ng，可滿(mǎn)足不同突變檢測(cè)方法對(duì)樣本的需要量。ARMS檢測(cè)結(jié)果證實(shí)不同F(xiàn)FPE樣本均含有預(yù)期PIK3CA基因型，見(jiàn)圖1。

圖1 PIK3CA室間質(zhì)評(píng)樣本熒光PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)

2.2均勻性評(píng)價(jià) 隨機(jī)抽取的10支突變型FFPE樣本的檢測(cè)結(jié)果均為預(yù)期PIK3CA突變型，野生型FFPE樣本經(jīng)檢測(cè)無(wú)特異性擴(kuò)增曲線(xiàn)，按照試劑盒結(jié)果判定規(guī)則判為野生型，表明室間質(zhì)評(píng)樣本的均勻性良好。

2.3穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 參評(píng)實(shí)驗(yàn)室上報(bào)結(jié)果后3 d檢測(cè)2～8 ℃保存的FFPE樣本，結(jié)果顯示均為預(yù)期PIK3CA基因型，表明該樣本在冷藏過(guò)程中具有良好穩(wěn)定性，可滿(mǎn)足室間質(zhì)評(píng)樣本傳遞要求。

2.4參評(píng)實(shí)驗(yàn)室整體回報(bào)情況 2018年和2019年報(bào)名參加PIK3CA基因突變檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)的實(shí)驗(yàn)室分別為30家和22家，規(guī)定時(shí)間內(nèi)收到有效回報(bào)結(jié)果分別為28份和19份，有效回報(bào)率分別為93.3%和82.6%。2018年參評(píng)實(shí)驗(yàn)室中8家為醫(yī)院病理科，20家為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所；2019年參評(píng)實(shí)驗(yàn)室中6家為醫(yī)院病理科，13家為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所。

2次室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)中，參評(píng)實(shí)驗(yàn)室中最常用方法為ARMS法(64.3%和73.7%)，其次為NGS(21.4%和15.8%)、Sanger測(cè)序(10.7%和5.3%)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)法(3.6%和5.3%)，見(jiàn)表1。

表1 參評(píng)實(shí)驗(yàn)室所用方法和檢測(cè)能力

注：其他，指參評(píng)實(shí)驗(yàn)室自建ARMS方法。

2.5室間質(zhì)評(píng)結(jié)果評(píng)價(jià) 按照結(jié)果評(píng)價(jià)原則，2018年22家實(shí)驗(yàn)室(78.6%)回報(bào)結(jié)果完全正確(100分)，1家實(shí)驗(yàn)室(3.5%)成績(jī)合格(80分)，5家實(shí)驗(yàn)室(17.9%)成績(jī)不合格(<80分)；2019年17家實(shí)驗(yàn)室(89.5%)回報(bào)結(jié)果完全正確(100分)，2家實(shí)驗(yàn)室(10.5%)成績(jī)不合格(<80分)，見(jiàn)表1。

2次室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)中，2018年和2019年樣本的整體符合率為86.4%和93.7%。除2019年野生型樣本全部合格外，其余9支樣本均出現(xiàn)檢測(cè)不合格情況，其中1812(E545K)樣本符合率最低為82.1%。不合格結(jié)果中，2018年有4家實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)12個(gè)假陽(yáng)性結(jié)果，5家實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)7個(gè)假陰性結(jié)果，其中2家實(shí)驗(yàn)室各自檢測(cè)的5個(gè)樣本均不合格；2019年2個(gè)假陽(yáng)性結(jié)果和4個(gè)假陰性結(jié)果均出自2家實(shí)驗(yàn)室，其余實(shí)驗(yàn)室回報(bào)結(jié)果全部正確，見(jiàn)表2。

表2 PIK3CA基因突變檢測(cè)樣本盤(pán)組成和室間質(zhì)評(píng)結(jié)果[%(n)]

3 討論

近些年來(lái)，針對(duì)特定靶點(diǎn)的分子靶向藥物越來(lái)越多地應(yīng)用于臨床，極大地改善了腫瘤患者預(yù)后并提高了其生存期。PIK3CA基因作為腫瘤靶向治療的重要預(yù)測(cè)因子，準(zhǔn)確地檢測(cè)其突變狀態(tài)對(duì)于篩選合適的腫瘤患者進(jìn)行靶向藥物治療至關(guān)重要。為全面評(píng)估臨床實(shí)驗(yàn)室相關(guān)項(xiàng)目檢測(cè)質(zhì)量，本中心組織實(shí)施了PIK3CA基因突變檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。

兩次室間質(zhì)評(píng)結(jié)果顯示成績(jī)優(yōu)秀實(shí)驗(yàn)室分別為78.6%和89.5%，這表明參評(píng)實(shí)驗(yàn)室突變檢測(cè)能力短期內(nèi)得到較大提高，但仍有進(jìn)步空間。與先前報(bào)道相一致[3-5]，假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果為主要錯(cuò)誤類(lèi)型，這將對(duì)腫瘤患者后續(xù)用藥造成極大不利影響。假陽(yáng)性情況在2018年室間質(zhì)評(píng)中表現(xiàn)更為明顯，4家實(shí)驗(yàn)室共計(jì)回報(bào)12個(gè)假陽(yáng)性結(jié)果，其中1家實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)5個(gè)錯(cuò)誤突變的假陽(yáng)性結(jié)果(均包含E545A突變)。推測(cè)其主要原因可能是人員操作(如交叉污染)或?qū)嶒?yàn)室污染(如氣溶膠)所致。因此，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)進(jìn)一步強(qiáng)化人員培訓(xùn)并嚴(yán)格采取分區(qū)操作的措施，且在檢測(cè)過(guò)程中需加入陰性質(zhì)控品，從而最大程度避免假陽(yáng)性情況發(fā)生。2018年室間質(zhì)評(píng)后參評(píng)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)針對(duì)性整改，2019年室間質(zhì)評(píng)假陽(yáng)性結(jié)果大幅降低(僅2個(gè))也進(jìn)一步證明了上述結(jié)論。兩次室間質(zhì)評(píng)的假陰性率分別為8.3%和5.3%，變化幅度不大。但63.6%(7/11)的假陰性結(jié)果是由實(shí)驗(yàn)室自建方法(Sanger測(cè)序和ARMS法)回報(bào)，這可能和實(shí)驗(yàn)室未對(duì)其進(jìn)行充分的性能確認(rèn)相關(guān)[7]。其他假陰性結(jié)果可能為人員操作不當(dāng)導(dǎo)致，如DNA抽提得率低、錯(cuò)加或漏加樣本等。但需指出的是，兩次室間質(zhì)評(píng)中實(shí)驗(yàn)室間錯(cuò)誤情況重復(fù)性低，不同檢測(cè)方法和突變檢測(cè)的錯(cuò)誤情況無(wú)直接相關(guān)性。

不同樣本類(lèi)型可用于分子病理項(xiàng)目的室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)中，包括患者組織樣本、質(zhì)粒DNA、細(xì)胞系等[8]。其中細(xì)胞系制備的FFPE樣本具有易于大批量制備、穩(wěn)定性好、可充分模擬臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)全程監(jiān)控等優(yōu)點(diǎn)。此外，還可將突變型和野生型細(xì)胞系進(jìn)行不同比例混合，從而制備含有不同突變比例的FFPE樣本[9]。因此，本研究選用細(xì)胞系制備的突變比例約為50%的FFPE樣本，包含臨床最為常見(jiàn)的E542K、E545K和H1047R 3種熱點(diǎn)突變[10]。其均勻性和穩(wěn)定性良好，可替代臨床組織樣本用于PIK3CA基因突變檢測(cè)能力的評(píng)估。考慮當(dāng)前臨床樣本多為小活檢或細(xì)胞學(xué)樣本，今后室間質(zhì)評(píng)中還需適當(dāng)降低每張切片的腫瘤細(xì)胞數(shù)量，以更好滿(mǎn)足臨床小樣本的突變檢測(cè)需求。

綜上所述，本研究結(jié)果表明大部分實(shí)驗(yàn)室PIK3CA突變檢測(cè)能力良好，但部分實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力尚需提高。室間質(zhì)量評(píng)價(jià)可改進(jìn)并提高臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量，從而為臨床合理靶向用藥提供更為有效地指導(dǎo)和幫助。此外，本次室間質(zhì)評(píng)主要針對(duì)分析中過(guò)程，今后我們也將重點(diǎn)對(duì)PIK3CA突變的分析前(如腫瘤細(xì)胞比例)和分析后(如報(bào)告闡述)過(guò)程進(jìn)行評(píng)估，以便更加全面地評(píng)價(jià)臨床實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力。