張瀟分，王燕敏，田國力(上海市兒童醫(yī)院&上海交通大學附屬兒童醫(yī)院篩查中心，上海 200040)

遺傳代謝病又稱先天性代謝異常(inborn errors of metabolism，IEM或inherited metabolic diseases，IMD)，是一大類有代謝功能缺陷的復雜遺傳病，涉及氨基酸、有機酸、脂肪酸、尿素循環(huán)、碳水化合物、類固醇、金屬、溶酶體等多種物質代謝障礙的疾病，主要由于基因突變導致機體生化代謝紊亂或酶活性改變，代謝產物蓄積，具有高度的遺傳異質性[1]。研究表明，大多數(shù)IEM屬于單基因遺傳病，以常染色體隱性遺傳或X-連鎖隱性遺傳為主[2]。IEM臨床表型廣泛且通常是非特異性的，并且癥狀的出現(xiàn)可發(fā)生于從胎兒到成年的任何年齡，盡管單一病種發(fā)病率較低但總體發(fā)病率較高，因此，IEM嚴重影響著人口的素質和生存質量。目前許多IEM可防、可治，飲食治療、藥物治療、手術治療及基因治療等可不斷改善部分患者的預后。對高?；純哼M行IEM篩查，能夠及時對疾病做出早期診斷，為患兒的治療、遺傳咨詢等方面提供個體化方案。

目前IEM實驗室檢測技術包括酶聯(lián)免疫法、熒光法、氣相色譜質譜技術(gas chromatography-mass spectrometry，GC/MS)、串聯(lián)質譜技術(tandem mass spectrometry，MS/MS)及下一代測序技術(next-generation sequencing, NGS)等[3]。隨著分子診斷學、分子遺傳學及基因測序、數(shù)字微流體等技術的快速發(fā)展，IEM的篩查與檢測取得了巨大成效。本文主要綜述了實驗室篩查與診斷技術在遺傳代謝病中的應用。

1 質譜技術

質譜技術主要是物質被電離成具有不同質荷比(m/z)的帶電粒子，這些帶電粒子根據(jù)m/z的大小在空間或時間上分離，形成圖譜，通過測定離子峰的強度來確定化合物的分子質量、分子結構和樣品濃度。目前，IEM的篩查與診斷中常用的質譜技術有GC/MS、MS/MS及其他質譜技術等。

1.1GC/MS GC/MS是由色譜分析儀和質譜分析儀兩部分組成，它通過氣相色譜儀將混合物中的組分分離后再通過質譜儀對分離的組分進行鑒定(定性分析)以及計算出精確的量(定量分析)。由于IEM中異常的代謝物質主要通過尿液排泄，因此，檢測尿中特征性代謝產物的種類和含量的變化，能夠為IEM的診斷提供可靠的依據(jù)。GC-MS技術具有高靈敏度、高特異性、高分離度、數(shù)據(jù)處理自動化、一次可檢測多種異常代謝產物等優(yōu)點，可以從尿液中檢測出132種有機酸，用于40多種代謝病的診斷，是目前常用的遺傳代謝病檢測方法之一。

自1966年Tanaka報道通過氣相色譜質譜聯(lián)用儀發(fā)現(xiàn)首例異戊酸血癥以來，GC-MS在遺傳代謝病的篩查與診斷中廣泛應用，并成為有機酸尿癥的主要診斷方法[4]。羅小平等[5]在2003年時將GC/MS技術引入國內。田國力等[6]采用GC-MS技術對5 778例遺傳代謝病高危兒尿液中132種代謝產物進行檢測，共有106例患兒被明確診斷出17種疾病，證實了GC-MS技術對有機酸代謝異常和部分氨基酸代謝異常診斷具有特異性。

尿液作為最常用的生物基質之一，具有無創(chuàng)性、背景物質少等優(yōu)點，由于尿代謝產物受多種因素如飲食、飲水量或疾病狀態(tài)等影響，故而GC/MS檢測尿有機酸存在一定的假陰性。另外，采用GC-MS技術對尿有機酸進行檢測需對樣本進行前處理，且樣本前處理步驟多，一份樣本檢測需要1 h，因此不適合使用GC-MS對大規(guī)?；颊呷巳哼M行篩查，但該技術仍然是目前最常用的遺傳代謝病檢測方法之一。

1.2MS/MS MS/MS由2個質譜儀經1個碰撞室串聯(lián)而成，理論上2～3 min內可對1個3 mm濾紙干血片上幾十種代謝產物進行分析，判斷數(shù)十種氨基酸、有機酸、脂肪酸氧化代謝紊亂的疾病，實現(xiàn)了“1次實驗檢測多種疾病”[7]。樣本采用濾紙干血片，通過鹽酸正丁醇衍生法及非衍生法2種樣本處理方法，對血中氨基酸及酰基肉堿水平進行檢測，具有高靈敏性、高特異性、快速、高通量的特點。顧學范等[8]于2002年通過MS/MS對遺傳代謝病進行篩查及檢測。Céspedes等[9]采用串聯(lián)質譜法確定哥倫比亞新生兒血液中氨基酸和?；鈮A的濃度水平，并建立參考區(qū)間以進一步用于IEM診斷，表明該技術在IEM篩查方面具有較高的精確性、準確性。除小分子物質外，目前MS/MS還可對一些大分子物質如溶酶體貯積癥(lysosomal storage disease，LSDs)、線粒體疾病等進行檢測[10]。串聯(lián)質譜技術已經發(fā)展成為遺傳代謝病篩查中應用廣泛的分析技術。在我國，MS/MS已用于新生兒氨基酸代謝障礙、有機酸血癥及脂肪酸氧化代謝障礙等遺傳代謝病篩查[11]，并形成了新生兒疾病串聯(lián)質譜篩查技術專家共識[12]。在IEM的診斷方面，通過MS/MS分析高?；純貉褐械陌被岷王；鈮A分布也得到了廣泛應用[13]。

MS/MS也具有一定的局限性，一方面質譜儀價格昂貴，另一方面MS/MS是一項非常復雜的系統(tǒng)，需要專業(yè)的技術人員來操作，實驗室質量控制要求高，同時也需要經驗豐富的醫(yī)師結合臨床或其他輔助診斷對結果進行正確判讀,將MS/MS與其他生化指標如酶學測定和分子生物學技術聯(lián)合應用也可幫助臨床醫(yī)生準確診斷患有可疑IEM的患兒。

1.3其他質譜技術 近年來，已經開發(fā)出商業(yè)化的超高性能超臨界流體色譜-串聯(lián)質譜(ultra-high performance supercritical fluid chromatography-tandem mass spectrometry，UHPSFC-MS/MS)系統(tǒng)[14]。該系統(tǒng)能將氣相色譜(gas chromatography，GC)的分辨率與超高效液相色譜(ultra-high performance liquid chromatography，UHPLC)的高通量功能結合在一起，已用于臨床上類固醇激素的檢測，這項新技術由于其復雜性，尚未完全應用于IEM的實驗室篩查及診斷。

2 分子診斷技術

體內的生化代謝物在疾病狀態(tài)和環(huán)境等因素的作用下，濃度水平會有所波動，在檢測過程中會有一些假陽性率和假陰性率的存在?；蛲蛔儥z測相對于代謝物檢測，結果更為可靠，診斷價值更高。分子診斷技術對DNA序列或對拷貝數(shù)變異進行分析，找出基因病變的部位，不受生理狀態(tài)和環(huán)境的影響，還能夠進一步檢測出家族中雜合子的攜帶者。因此，分子診斷在IEM的病因學診斷中占據(jù)重要地位[15]。目前IEM篩查的分子診斷技術主要包括PCR技術、基因芯片技術、高通量測序等。

2.1PCR技術 PCR技術包括高分辨率熔解曲線分析(high resolution melting analysis，HRM)、多重連接依賴式探針擴增分析(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)等。HRM可以對超長脂酰輔酶A脫氫酶缺乏等已知突變或熱點突變進行檢測，是一種敏感性強、特異性高的檢測技術，目前已用于多種IEM基因突變的檢測[16]。孫婧婧等[17]采用HRM技術快速診斷1例瓜氨酸血癥Ⅰ型患兒的ASS1基因純合突變。Islam等[16]使用酶法和HRM分析法對63例臨床可疑女性進行了G6PD狀態(tài)評估，結果發(fā)現(xiàn)除了G6PD酶測定，HRM曲線分析可作為對G6PD雜合子有效補充分析方式。

此外，MLPA可以對染色體異?；蚧虻目截悢?shù)變異進行分析(如復制或缺失)，檢測單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNPs)和點突變，對mRNA進行量化。目前可應用于眾多研究領域，如先天性腎上腺皮質增生癥、苯丙酮尿癥、假性甲狀旁腺機能減退、丙酸血癥等[18-19]。MLPA是一種具有高靈敏度、高特異性、高通量的檢測技術，具有準確性高，重復性好的特點。Nagasaki等[20]通過MLPA技術對1例有神經肌肉癥狀的假性甲狀旁腺功能減退癥Ib型(PHP-Ib)患者GNAS基因進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)其GNAS基因外顯子A/B的甲基化缺陷并涉及GNAS鄰近基因STX16外顯子4～6的微缺失，表明MLPA是篩查臨床非典型癥狀患者GNAS突變的有效工具。

2.2基因芯片技術 染色體微陣列芯片分析(chromosome microarray analysis，CMA)即染色體基因組芯片，也稱基因芯片技術。與傳統(tǒng)遺傳學檢測方法相比，基因芯片技術具有高通量的特點，它能夠在1張芯片上對整個基因組的基因拷貝變異(copy number variations，CNVs)進行檢測。同時，基因芯片檢測效率較高，能夠檢測小于1×105bp甚至1×103bp的拷貝數(shù)變異。由于IEM種類繁多，50%～70%的IEM發(fā)生在兒童，以智力發(fā)育遲緩合并其他組織器官異常多見，臨床表現(xiàn)復雜。目前基因芯片技術在不明原因的兒童發(fā)育遲緩、智力落后、多發(fā)畸形等方面的臨床應用已獲得美國FDA批準，在該方面的應用相對成熟[21]。近幾年，我國CMA的臨床應用逐步推廣，為眾多遺傳病患者提供了精確分子診斷，形成了CMA在兒科遺傳病的臨床應用專家共識，共識中對具有以下臨床表型的疾病，建議將CMA作為一線檢測手段，包括：(1)不明原因的智力落后和(或)發(fā)育遲緩；(2)非已知綜合征的多發(fā)畸形；(3)自閉癥譜系障礙。

2.3Sanger測序 Sanger測序技術屬于經典的基因診斷技術，能夠將基因中部分小片段的插入/缺失突變以及大部分的點突變檢測出來。是目前在IEM實驗室篩查與診斷中應用最為廣泛、最成熟的分子診斷技術。謝波波等[22]采用Sanger測序對1例瓜氨酸血癥Ⅰ型進行家系基因檢測，并對ASS1基因14個外顯子進行DNA測序，檢測到患兒存在c.951delT(F317LfsX375)和c.1087C >T (R363W)2個雜合突變，并闡明其病因，為該病的診斷和遺傳咨詢提供依據(jù)。但由于Sanger測序技術通量不足，檢測范圍有限，使其在應用上還存在一定的局限性。

2.4NGS NGS能夠在一次實驗中快速完成對個體的全基因組測序，檢測單個個體全部的DNA序列，對DNA序列的點突變、重復、缺失及序列多態(tài)性等進行揭示，相對于傳統(tǒng)的Sanger測序技術，具有高靈敏度、高通量，低成本的優(yōu)勢，在單基因遺傳病的基因篩查和診斷中具有廣闊的臨床應用前景。NGS技術按測序目標序列的大小，可分為全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)和靶向重測序。靶向重測序又可分為全外顯子組測序(whole exome sequencing，WES)、臨床外顯子組測序(medical exome sequencing，MES)、靶向疾病基因包(Panel)等。基于下一代測序技術，特別是利用WES和WGS 兩種方法發(fā)現(xiàn)基因變異，被越來越多的應用于IEM的篩查與臨床診斷中。近年來，利用NGS技術進行IEM分子診斷的研究獲得越來越多的關注。目前，已建立了針對脂質沉積性肌病[23]、溶酶體貯積病[24]、嬰兒型線粒體疾病[25]、先天性糖基化缺陷病[26]等疾病的分子診斷方法，取得了良好的效果。

有學者采用NGS技術對72例高?；純哼M行WES，共發(fā)現(xiàn)了98個不同的突變，其中27個未見報道，其還發(fā)現(xiàn)43.06%(31/72)的患兒患有11種常見疾病，其中多數(shù)是IEM和神經遺傳性疾病[27]。Yang等[28]應用WES技術對250個不同表型的遺傳性疾病患者進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)至少有25%的患者得到明確的基因診斷。Lindstrand等[29]對高?；純篒ME的診斷使用短讀WGS，結果發(fā)現(xiàn)相比于臨床染色體微陣列分析(CMA)，其總體診斷率提高了27%，使用WGS還可以高精度檢測到各種結構變異(structural variant，SV)，由于WGS數(shù)據(jù)可以分析單核苷酸變異(single nucleotide variants, SNV)，單親二倍體(uniparentaldisomy，UPD)和短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat，STR)，故而在臨床診斷實驗室中常用于綜合基因測試。

NGS技術已成為目前診斷IEM新致病基因的重要研究工具。但由于NGS技術還在發(fā)展中，臨床應用的時間也較短，對于新發(fā)現(xiàn)的DNA突變需進一步驗證，對于意義不明的新突變亦需進一步進行功能學的研究，確定其是否具有臨床意義。對于某些DNA變異，其致病性不能確定；對于查出的一些致病基因，患兒會何時發(fā)病也不能確定；發(fā)病后何時干預以及如何進行干預、如何做好遺傳咨詢；建立實驗室標準化操作；以上都會給NGS技術在IEM中的全面應用帶來極大的挑戰(zhàn)。

3 數(shù)字微流體技術

數(shù)字微流控技術(digital microfluidics，DMF)是一種新興的液體處理技術，可以在軟件控制下將液體作為離散的微滴進行處理。這些皮升至微升大小的液滴，每個都可以作為化學反應的微容器，使流體在其中分配、運輸、混合、孵育和檢測。

DMF技術是一種經濟高效的新平臺，目前用于IEM實驗室篩查的免疫測定和酶活性測定方法都可以在一次性微芯片上進行。將DMF技術和納米電噴離子化MS/MS結合使用,可將樣本提取、衍生化和代謝物分析整個過程集中在1個芯片上，整個過程中消耗的樣品和試劑大約是等效臺式測定所需的樣品和試劑的1%，很大程度上增加檢測通量，減低檢測成本[30]。高通量DMF平臺(又稱為SEEKER)最近獲得了美國FDA的授權，該平臺可以針對4種溶酶體酶進行多重測定，可以同時篩查包括Ⅰ型粘多糖貯積病(mucopolysaccharidosis type I，MPSI)、龐貝氏癥(Pompedisease)、戈謝病(Gaucherdisease)和法布里病(Fabry)在內的4種溶酶體貯積病(lysosomal storage disorders，LSD)，并且已經加入了美國新生兒篩查計劃中[31]。除了免疫學和酶學檢測，還可使用基于DMF的微芯片和控制設備對DNA進行擴增。有學者通過基于DNA方法的DMF技術對T細胞受體切除環(huán)(T-cell receptor excision circles，TREC)進行檢測，以篩查新生兒或高?；純褐匕Y聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immune deficiency，SCID)[32]。以上方法表明，DMF技術在IEM篩查和檢測中具有較大的臨床應用潛力。

4 結語

個體化醫(yī)療與精準醫(yī)療的快速發(fā)展很大程度上依賴于準確、可靠的檢測結果。高新檢測技術如質譜技術、分子診斷技術和微流體技術有望在IEM實驗室檢測領域帶來革命性的變化。隨著IEM各種診斷新技術的快速發(fā)展，將規(guī)范化、標準化貫穿于整個檢測過程，才能最大程度上使新技術在IEM檢測中獲得收益，臨床醫(yī)師也應提高對結果的正確解讀能力。目前來講，將各種篩查技術聯(lián)合應用可對IEM進行全面檢測，能顯著提高靈敏度及特異性，避免單一方法的漏診，這也是未來的發(fā)展方向之一。