舒理建 樓賽麗 吳晨皓 盧鑫鑫 邵旭民（浙江普洛康裕制藥有限公司，浙江 東陽(yáng)322118）

苯磺貝他斯汀是非鎮(zhèn)靜類(lèi)高選擇性組胺受體拮抗劑，對(duì)肥大細(xì)胞具有穩(wěn)定作用，能夠阻止嗜酸性粒細(xì)胞遷移至炎癥組織，并可抑制白細(xì)胞介素-5、白三烯B4（LTB4）和血小板活化因子（PAF），減輕過(guò)敏炎癥，是一種高效的抗過(guò)敏藥物，不良反應(yīng)較輕微。[1-3]苯磺貝他斯汀的合成過(guò)程中采用了乙醇和異丙醇，易與苯磺酸反應(yīng)生成苯磺酸乙酯和苯磺酸異丙酯。兩者為基因毒性雜質(zhì)，人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）于2014年發(fā)布M7（基因毒性雜質(zhì)指南）。指南中對(duì)基因毒性雜質(zhì)限度計(jì)算做了指導(dǎo)，計(jì)算得出苯磺貝他斯汀中含苯磺酸乙酯和苯磺酸異丙酯的限度均為75 ppm。歐洲藥典采用液相質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行苯磺酸乙酯含量測(cè)定，但儀器昂貴，在藥企不能廣泛適用。所以，建立了該方法并做了方法學(xué)驗(yàn)證。

1 儀器與材料

1260 高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器，美國(guó)Agilent 公司）；MILLIPOR超純水機(jī)（德國(guó)默克公司）；DK-360HTD超聲清洗儀（深圳市得康洗凈電器有限公司）；XS105十萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士梅特勒公司）。乙腈（色譜純，德國(guó)merck公司）；磷酸（色譜純，德國(guó)CNW公司）。苯磺貝他斯汀片（日本田邊三菱制藥株式會(huì)社）；苯磺酸乙酯對(duì)照品（TCI 公司）；苯磺酸異丙酯對(duì)照品（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用ACE 3 C8色譜柱(150*4.6 mm，3 um)；流動(dòng)相為乙腈—0.1%磷酸水溶液=1：3，等度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；流速為0.9 ml×min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為20 ul。

2.2 溶液的配制

空白溶劑（稀釋劑）： 取乙腈和水，以95：5比例混合，即得。

苯磺酸乙酯對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制：精密稱(chēng)取苯磺酸乙酯約144 mg，置50 ml 量瓶中，用稀釋劑溶解，并稀釋至刻度，搖勻；另精密量取此溶液1 ml置于100 ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，得苯磺酸乙酯對(duì)照品儲(chǔ)備液。

苯磺酸異丙酯對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備：精密稱(chēng)取苯磺酸異丙酯144 mg，置50 ml 量瓶中，用稀釋劑溶解，并稀釋至刻度，搖勻；另精密量取此溶液1 ml 置于100 ml 量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，得苯磺酸異丙酯對(duì)照品儲(chǔ)備液。

對(duì)照溶液配制：分別精密量取苯磺酸乙酯對(duì)照品儲(chǔ)備液1ml和苯磺酸異丙酯對(duì)照品儲(chǔ)備液1 ml，置同一10 ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

系統(tǒng)適用性溶液：即對(duì)照溶液。

供試品溶液配制：苯磺貝他斯汀片研磨成均勻粉末，取約0.32 g，精密稱(chēng)定，置10 ml 量瓶中，用稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

在上述色譜條件下，取苯磺酸乙酯與苯磺酸異丙酯對(duì)照溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積的RSD 分別為1.20%和1.45%，均小于2.0%。

2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取苯磺貝他斯汀片粉末約0.32 g，精密稱(chēng)定，置10 ml 量瓶中，用少許稀釋劑溶解，加入1 ml 苯磺酸乙酯儲(chǔ)備液和1 ml 苯磺酸異丙酯儲(chǔ)備液，用稀釋劑稀釋之刻度，搖勻，進(jìn)樣。結(jié)果表明其他未知雜質(zhì)與苯磺酸乙酯、苯磺酸異丙酯分離度良好。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.5 檢測(cè)限與定量限

分別精密量取苯磺酸乙酯和苯磺酸異丙酯對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，采用逐步稀釋法進(jìn)行檢測(cè)限與定量限測(cè)定。在220 nm的檢測(cè)波長(zhǎng)下，信噪比＞3時(shí)的濃度為檢測(cè)限，信噪比＞10時(shí)的濃度為定量限。苯磺酸乙酯的檢測(cè)限和定量限分別為0.000032 mg×ml-1（信噪比為3.6）和0.00032 mg×ml-1（信噪比為22.2）。苯磺酸異丙酯的檢測(cè)限和定量限分別為0.000064 mg×ml-1（信噪比為6.5）和0.00032 mg×ml-1（信噪比為14.4）。在定量限濃度下，樣品重復(fù)進(jìn)樣6 次，苯磺酸乙酯和苯磺酸異丙酯的峰面積RSD分別為2.55%和2.42%，均滿(mǎn)足測(cè)定要求。

2.6 線性范圍

取苯磺酸乙酯與苯磺酸異丙酯對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別精密量取 適 量，配 制 成0.00032，0.00064，0.00096，0.00192，0.0024，0.00288 mg×ml-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在220 nm 的檢測(cè)波長(zhǎng)下進(jìn)樣分析，以濃度（C，mg×ml-1）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸線性分析，苯磺酸乙酯的線性方程為A=24327C+0.4199，相關(guān)系數(shù)r 為0.9989，苯磺酸異丙酯的線性方程為A=19830C+1.7887，相關(guān)系數(shù)r，0.9986，說(shuō)明苯磺酸乙酯和苯磺酸異丙酯的峰面積與其濃度在0.00032 mg×ml-1-0.00288 mg×ml-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

在苯磺貝他斯汀片中分別加入80%限度，100%限度，120%限度三個(gè)水平的各組分三份，計(jì)算各組分的加樣回收率，見(jiàn)表1和表2，苯磺酸乙酯與苯磺酸異丙酯回收率在93.0%-102.2%之間，結(jié)果說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度良好。

表1 苯磺酸乙酯加樣回收率測(cè)定結(jié)果

表2 苯磺酸異丙酯加樣回收率測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

建立了苯磺貝他斯汀片中對(duì)基因毒性雜質(zhì)苯磺酸乙酯與苯磺酸異丙酯的HPLC方法。結(jié)果顯示，該方法的專(zhuān)屬性良好，檢測(cè)限較低[4]，線性關(guān)系和回收率均良好，能夠滿(mǎn)足類(lèi)該基因毒性雜質(zhì)的分析要求。與HPLC-MS和HPLC-MS/MS比較，HPLC在制藥企業(yè)的日常檢測(cè)中更適用、更廣泛，值得推廣應(yīng)用。