謝廣發(fā)，蔡際豪，錢斌，王蘭，魯振東，呂飛*，丁玉庭*

1(浙江樹人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 紹興，312028) 2(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州，310000) 3(國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江 紹興，312000) 4(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

黃酒是我國的民族特產(chǎn)，具有悠久的歷史。傳統(tǒng)的黃酒釀造是以自然培養(yǎng)酒母和麥曲作糖化發(fā)酵劑，發(fā)酵周期長達(dá)70～90 d，出酒率低，設(shè)備利用率低，勞動(dòng)強(qiáng)度大，且受季節(jié)性影響較大[1-2]。機(jī)械化釀造以大罐代替缸、壇，進(jìn)行前、后發(fā)酵，用機(jī)械化、管道化代替原來的人工輸送，用純種酵母和麥曲代替或部分代替自然培養(yǎng)的淋飯酒母和塊曲。機(jī)械化黃酒釀造具有占地面積小、質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定、勞動(dòng)生產(chǎn)率高、勞動(dòng)強(qiáng)度低等優(yōu)點(diǎn)，逐漸被黃酒企業(yè)所采用，被認(rèn)為是今后黃酒發(fā)展的方向[3-5]。

由于黃酒獨(dú)特的原料和釀造工藝，使其具有獨(dú)特且復(fù)雜的香氣特征，黃酒主要風(fēng)味成分有揮發(fā)性物質(zhì)、有機(jī)酸、多酚、脂肪酸、糖類、氨基酸等[6-7]。原料、糖化發(fā)酵劑、釀造過程、貯藏時(shí)間等都影響著黃酒中風(fēng)味成分的形成[8]。近年來，黃酒風(fēng)味物質(zhì)及其形成機(jī)制的研究越來越受到重視。LIU等[9]和HUANG等[10]研究了黃酒發(fā)酵中風(fēng)味物質(zhì)與微生物群落的相關(guān)性，找到了產(chǎn)生特征風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)鍵微生物群落；YANG等[11]通過培育耐乙醇和活性高的酵母來改善黃酒風(fēng)味，得到香氣和口感更佳的黃酒；馮愛軍等[12]采用HPLC法對(duì)客家娘酒及紹興黃酒中10種有機(jī)酸進(jìn)行定性、定量分析，結(jié)果表明不同酒種、不同品牌的酒中所含有機(jī)酸的種類和數(shù)量存在一定的差異；李國輝等[13]建立了以N-(特丁基二甲基硅烷)-N-甲基三氟乙酰胺為衍生試劑的GC-FID方法，并測定了黃酒中17種游離氨基酸；WANG等[14]利用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HS-SPME-GC-MS)、高效液相色譜法對(duì)紹興地區(qū)黃酒發(fā)酵過程不同階段風(fēng)味物質(zhì)的變化進(jìn)行了研究，并對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性進(jìn)行了分析；洪家麗等[15]和郭偉靈等[16]研究紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造過程中的揮發(fā)性風(fēng)味及菌群結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。

隨著人們生活水平的提高和健康意識(shí)的增強(qiáng)，干型黃酒越來越受到消費(fèi)者青睞，但上述研究主要針對(duì)半干型或甜型黃酒[17-20]，而對(duì)于干型黃酒風(fēng)味物質(zhì)的組成及動(dòng)態(tài)變化未見報(bào)道，這在一定程度上制約了干型黃酒產(chǎn)品質(zhì)量的提高。本研究采用高效液相色譜及頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)干型機(jī)械化黃酒中的揮發(fā)性組分、有機(jī)酸、氨基酸等進(jìn)行初步分析測定，并且利用主成分分析對(duì)不同發(fā)酵階段的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行差異性比較，以期為今后干型黃酒的風(fēng)味研究和品質(zhì)控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

機(jī)械化干型黃酒釀造過程不同階段發(fā)酵醪樣品，取自某大型紹興黃酒生產(chǎn)企業(yè)。取樣時(shí)間點(diǎn)為2、4、6、10、14、18 d，每個(gè)過程各取3批次，樣品經(jīng)4層紗布過濾后存放于-4 ℃冰箱中，15 d內(nèi)完成分析。

1.2 儀器與設(shè)備

E2695型高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器)，美國Waters公司；TRACE1300-ISQQD氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技公司；固相微萃取裝置(配50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭)，美國Supelco公司；HYJD超純水器，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；FA2004型電子分析天平，常州市衡正電子儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 常規(guī)理化指標(biāo)的測定

總酸、還原糖、酒精度：分別采用酸度計(jì)法、廉愛農(nóng)法、酒精計(jì)法測定[21-22]。

1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定[23-24]

1.3.2.1 頂空固相微萃取條件

不同階段樣品先經(jīng)3 000 r/min離心20 min，取5 mL離心后的樣品，放入20 mL頂空瓶，加入5 μL內(nèi)標(biāo)物(2-辛醇，質(zhì)量濃度為89.65 μg/L)，2.5 g NaCl，萃取溫度50 ℃，預(yù)熱15 min，萃取時(shí)間40 min，GC解吸5 min(250 ℃)。

1.3.2.2 GC-MS 條件

色譜條件：色譜柱型號(hào)為DB-Wax毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱初始溫度40 ℃保持5 min，以5 ℃/min的速度上升至150 ℃，再以10 ℃/min的速度上升至230 ℃，然后保持10 min。載氣為高純度氦氣，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：接口溫度為230 ℃，電子轟擊EI離子源，掃描范圍(m/z)為30～550 amu，電子能量為70 eV，離子源溫度是230 ℃。

1.3.3 有機(jī)酸含量的測定

1.3.3.1 樣品預(yù)處理

取5 mL離心后的樣品倒入25 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容到刻度，然后經(jīng)0.22 μm膜過濾，直接進(jìn)樣。

1.3.3.2 色譜條件[25-26]

色譜柱：Kromasil 100-5 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.08 mol/L KH2PO4溶液(用H3PO4調(diào)節(jié)pH至2.80)；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μm；檢測波長215 nm；柱溫30 ℃。

1.3.4 游離氨基酸含量的測定

1.3.4.1 樣品預(yù)處理

取標(biāo)樣(半胱氨酸為1.25 mmol/L，其余16種氨基酸濃度為2.5 mmol/L)或離心后的樣品50 μL，置于2 mL離心管中，加150 μL高純水，再加入0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL、1 mol/L三乙胺乙腈溶液100 μL，混勻。室溫下放置1 h后，加入400 μL正己烷，旋渦混合器振蕩1 min，靜置10 min。棄去上層正己烷溶液，下層溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)樣，進(jìn)行色譜分析。

1.3.4.2 色譜條件[27-28]

色譜柱：Kromasil 100-5 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫38 ℃；檢測波長254 nm；流量1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相：A 0.1mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液，B 1 mol/L三乙胺乙腈溶液，C體積分?jǐn)?shù)1%的乙酸溶液，D醋酸鈉緩沖鹽溶液。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度程序Table 1 Gradient program

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

用EXCEL 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用SPSS 17.0進(jìn)行主成分分析，Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 干型黃酒釀造過程中理化指標(biāo)變化

干型黃酒釀造過程中理化指標(biāo)變化如圖1 所示。隨著糖化發(fā)酵的進(jìn)行，酒精度和總酸一直呈上升趨勢，還原糖呈下降趨勢，但后期變化趨于緩慢，變化規(guī)律與其他類型黃酒基本一致[29-30]。在發(fā)酵初期，發(fā)酵醪中的酒精度和總酸都處于較低水平且發(fā)酵所需營養(yǎng)充足，酵母、產(chǎn)酸菌等微生物大量繁殖，導(dǎo)致酒精度和總酸較快上升，還原糖消耗較快；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，酒精度和總酸含量也達(dá)到一定水平，對(duì)酵母和產(chǎn)酸菌的活動(dòng)有一定抑制作用，酒精度、總酸和還原糖的變化也趨于緩慢。

圖1 半干型黃酒釀造理化指標(biāo)的變化曲線Fig.1 Changes in physicochemical indices during dryHuangjiu brewing process

2.2 干型黃酒釀造過程揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化

干型黃酒釀造過程中樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測結(jié)果和變化趨勢分別見表2和圖2，各種風(fēng)味物質(zhì)含量采用內(nèi)標(biāo)半定量得到。不同階段樣品中檢出的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有醇類、醛類、酸類和酯類。醇類主要為異戊醇和β-苯乙醇，發(fā)酵2 d達(dá)到74.34和65.42 mg/L，釀造中后期醇類(高級(jí)醇)略有減少。一般認(rèn)為，高級(jí)醇是酵母增殖的副產(chǎn)物，前期酵母大量增殖，生成的高級(jí)醇較多，而中后期酵母增殖少，生成的高級(jí)醇少[31-32]。由于黃酒發(fā)酵是敞口發(fā)酵，且釀造過程中需要用壓縮空氣開耙，造成高級(jí)醇揮發(fā)損失，同時(shí)部分醇類物質(zhì)與有機(jī)酸作用生成酯類物質(zhì)，使高級(jí)醇含量略有下降。醛類化合物在2 d含量達(dá)到最高，之后呈下降趨勢，檢測到的醛類有苯甲醛、苯乙醛、糠醛、壬醛、癸醛、2-苯基-2-丁烯醛和5-甲基糠醛7種。酯類物質(zhì)種類最多，檢測到20種，主要為乙酯類和乙酸酯類。酯類在釀造前期生成較快，后期緩慢上升，主要酯類物質(zhì)乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯在14 d達(dá)到37.76、24.56、25.12 mg/L。揮發(fā)酸檢測到4種，分別是乙酸、己酸、戊酸和辛酸。

香氣物質(zhì)的貢獻(xiàn)多以香氣活力值，即含量與香氣閾值的比值來評(píng)價(jià)。醇類中β-苯乙醇和丁醇的香氣閾值分別為28和2.7 mg/L；醛類中苯甲醛、壬醛的香氣閾值分別為1和0.12 mg/L；酯類中乙酸乙酯的香氣閾值為32 mg/L、丁酸乙酯為0.081 mg/L、戊酸乙酯為0.027 mg/L、己酸乙酯為0.055 mg/L、辛酸己酯為0.02 mg/L、γ-壬內(nèi)酯為0.09 mg/L、苯甲酸乙酯為1.4 mg/L、苯乙酸乙酯為0.1 mg/L；揮發(fā)酸中乙酸和戊酸的香氣閾值分別為2.5和0.39 mg/L[33-35]，這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在干型酒中的香氣活力值較大，可能對(duì)干型黃酒的風(fēng)味形成有較大的貢獻(xiàn)。

表2 干型黃酒釀造過程揮發(fā)性風(fēng)味成分含量的變化Table 2 Changes in volatile flavor components content during dry Huangjiu brewing process

注：“-”表示未檢出

圖2 半干型黃酒釀造過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化曲線Fig.2 Changes in volatile flavor components content duringdry Huangjiu brewing process

2.3 干型黃酒釀造過程揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的PCA分析

以18個(gè)樣品的46種揮發(fā)性成分含量構(gòu)成18×46的矩陣，利用SPSS17.0進(jìn)行主成分分析，按照剔除最小特征值的主成分中對(duì)應(yīng)的最大特征向量的變量的原則，一次剔除一個(gè)變量，然后利用剩余變量再進(jìn)行主成分分析，經(jīng)過有限次剔除后，保留的成分有苯甲酸乙酯、丙醇、壬醇、戊酸、戊酸乙酯、異戊醇、壬醛、乙酸苯乙酯、苯乙醇、苯甲醇、2,3-丁二醇、辛醇、乙酸己酯、甲酸苯乙酯、丁二酸單乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯、乳酸異戊酯、糠醇、γ-壬內(nèi)酯，辛酸、己酸。提取的第一、二主成分的方差貢獻(xiàn)率累計(jì)達(dá)到了86.47%，其中第一主成分(PC1)構(gòu)成的信息量占總信息量的58.82%，第二主成分(PC2)占27.65%，如圖3所示。

由圖3可知，2 d位于第二象限，主要特征揮發(fā)性成分為苯甲酸乙酯、丙醇、壬醇、戊酸、戊酸乙酯、壬醛；4 d與6 d均位于第一象限，主要特征揮發(fā)性成分為乙酸苯乙酯、苯乙醇、異戊醇、苯甲醇、2,3-丁二醇、辛醇、乙酸己酯、甲酸苯乙酯；10、14和18 d均位于第四象限，主要特征揮發(fā)性成分為丁二酸單乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯、乳酸異戊酯。發(fā)酵前期與后期樣品的揮發(fā)性成分差異性較大，前期位于X軸的上方，后期位于下方。2、4、6 d的點(diǎn)可以很好區(qū)分開，而10、14、18 d的點(diǎn)較為聚攏，表明在發(fā)酵前期樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化比較大，發(fā)酵后期變化趨于平緩。

A1-丙醇；A3-異戊醇；A4-β-苯乙醇；A5-2,3-二丁醇；A7-辛醇；A8-壬醇；A9-糠醇；A14-苯甲醇；B1-乙酸乙酯;B2-乳酸乙酯;B3-丁酸乙酯;B4-丙酸乙酯;B5-戊酸乙酯;B6-己酸乙酯;B10-γ-壬內(nèi)酯;B13-乳酸異戊酯;B14-丁二酸單乙酯;B15-苯甲酸乙酯;B16-甲酸苯乙酯;B17-苯乙酸乙酯;B18-乙酸苯乙酯;C4-壬醛;D2-己酸;D3-戊酸;D4-辛酸圖3 干型黃酒釀造過程揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分載荷圖Fig.3 PCA loading plot of volatile flavor componentsduring dry Huangjiu brewing process

2.4 干型黃酒釀造過程有機(jī)酸含量變化

有機(jī)酸是黃酒中重要的呈味物質(zhì)，有增強(qiáng)黃酒的濃厚感，降低甜度等作用[25,36]。實(shí)驗(yàn)共測定7種有機(jī)酸，分別是乙酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸和丙酮酸，其含量和變化趨勢如表3所示。

表3 干型黃酒釀造過程有機(jī)酸含量的變化 單位：mg/L

在干型黃酒釀造過程中，有機(jī)酸總量呈增加趨勢，其中含量最高的有機(jī)酸是乳酸，18 d為3 427.5 mg/L。酒石酸、檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸在發(fā)酵過程中一直呈上升趨勢，其中檸檬酸和蘋果酸參與三羧酸循環(huán)，不會(huì)大量積累，其含量遠(yuǎn)低于乳酸和乙酸。乙酸含量在發(fā)酵過程中先增后減，在第10天達(dá)到最大值，為787.5 mg/L，可能由于揮發(fā)和酯化反應(yīng)所致。所有的有機(jī)酸中，丙酮酸含量最低，最高含量僅為28.9 mg/L，這是因?yàn)楸嶙鳛樘墙徒庾詈笠徊降漠a(chǎn)物，是諸多代謝產(chǎn)物的前體，在發(fā)酵過程中會(huì)被大量消耗。

2.5 干型黃酒釀造過程氨基酸含量變化

氨基酸具有獨(dú)特的滋味，如谷氨酸、天門冬氨酸、賴氨酸、蛋氨酸等呈鮮味; 絲氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸等呈甜味; 酪氨酸呈澀味；異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、組氨酸、精氨酸等呈苦味[37-38]。如表4所示，在干型黃酒釀造過程中，游離氨基酸含量一直呈上升趨勢，發(fā)酵第18天達(dá)到2 234.4 mg/L。這與傳統(tǒng)半干型黃酒釀造過程的氨基酸變化規(guī)律不同，傳統(tǒng)半干型黃酒在釀造前期氨基酸含量緩慢上升，而在后期發(fā)酵最后1個(gè)月氨基酸含量快速上升[28]。氨基酸在發(fā)酵前期主要由原料帶入以及原料蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)生，后期與酵母菌、霉菌等微生物自溶有關(guān)。干型黃酒中含量較高的游離氨基酸是丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、谷氨酸、甘氨酸，第18天分別達(dá)到428.7、355.6、243.6、201.8和201.9 mg/L，多為甜味和苦味氨基酸。由于氨基酸的種類和含量對(duì)黃酒的口味有重要影響，所以氨基酸譜的差異性已被應(yīng)用于黃酒的鑒定[39]，如何通過對(duì)釀造過程中氨基酸的調(diào)控來得到具有特定風(fēng)味的黃酒的問題還有待今后進(jìn)一步研究。

表4 干型黃酒釀造過程游離氨基酸含量變化 單位：mg/L

2.6 半干型黃酒釀造過程氨基酸和有機(jī)酸的PCA分析

以18個(gè)樣品的23種有機(jī)酸與游離氨基酸含量構(gòu)成18×23的矩陣，利用SPSS 17.0進(jìn)行主成分分析，按照剔除最小特征值的主成分中對(duì)應(yīng)的最大特征向量的變量的原則，一次剔除一個(gè)變量，然后利用剩余變量再進(jìn)行主成分分析，保留的成分有乙酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸、丙酮酸、天門冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸。提取的第一、二主成分的方差貢獻(xiàn)率累計(jì)達(dá)到了74.14%，其中第一主成分(PC1)構(gòu)成的信息量占總信息量的47.21%，第二主成分(PC2)占26.93%，如圖4所示。

由圖4可知，發(fā)酵2 d與4 d均位于第二象限，主要特征成分為天門冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和賴氨酸；6 d與10 d位于第一象限，主要特征成分為酒石酸、琥珀酸、蘋果酸、谷氨酸、脯氨酸；14 d與18 d位于第四象限，主要特征成分為醋酸、乳酸、丙氨酸、組氨酸和精氨酸。每一發(fā)酵階段的點(diǎn)都能很好分開，表明每一發(fā)酵階段的有機(jī)酸和氨基酸含量差異明顯。2、4、6 d的點(diǎn)距離10、14、18 d的點(diǎn)分開較遠(yuǎn)，發(fā)酵前期與發(fā)酵后期可以較好區(qū)分。丙酮酸與第一主成分呈負(fù)相關(guān)，乙酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸和琥珀酸與第一主成分呈現(xiàn)較高正相關(guān)。

F1-乙酸;F2-乳酸;F4-蘋果酸;F5-酒石酸;F6-琥珀酸;F7-丙酮酸;G1-天門冬氨酸;G2-蘇氨酸;G4-谷氨酸;G5-脯氨酸;G7-丙氨酸;G8-纈氨酸;G10-異亮氨酸;G11-亮氨酸;G14-賴氨酸;G15-組氨酸;G16-精氨酸圖4 半干型黃酒釀造過程有機(jī)酸和游離氨基酸主成分載荷圖Fig.4 PCA loding plot of organic acids and free aminoacids during semi-dry Huangjiu brewing process

3 結(jié)論

干型機(jī)械化黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量在發(fā)酵前4 d快速上升，后期上升緩慢，2 d的主要特征揮發(fā)性組分為苯甲酸乙酯、丙醇、壬醇、戊酸、戊酸乙酯、壬醛，4 d與6 d主要特征揮發(fā)性組分為乙酸苯乙酯、苯乙醇、異戊醇、苯甲醇、2,3-丁二醇、辛醇、乙酸己酯、甲酸苯乙酯，10 d后主要特征揮發(fā)性組分為丁二酸單乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯、乳酸異戊酯。有機(jī)酸和游離氨基酸總含量呈增長趨勢，2 d與4 d主要特征成分為天門冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和賴氨酸，6 d與10 d主要特征成分為酒石酸、琥珀酸、蘋果酸、谷氨酸、脯氨酸，14 d與18 d主要特征成分為醋酸、乳酸、丙氨酸、組氨酸和精氨酸。