武美彤，張海欣，張夢, 3，畢園，徐昊然，凌空，金其貫*，劉文穎*

1(揚(yáng)州大學(xué) 體育學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州，225127) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京，100015) 3(江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安，223003)

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肺癌在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家均為惡性腫瘤發(fā)病率的第一位，并預(yù)測2020年在發(fā)展中國家其發(fā)病率仍居首位[1]。在我國，肺癌的發(fā)病率比20世紀(jì)70年代上升了465%，居于癌癥死亡的首位[2]。盡管肺癌的治療技術(shù)日新月異，但現(xiàn)有的抗腫瘤藥物只能緩解病情，5年生存率從僅有的4%上升到12%左右，平均無進(jìn)展生存期僅延長3～5個(gè)月[3]。因此，肺癌的治療效果仍不能令人滿意。牡蠣(oyster)俗稱海蠣子，肉質(zhì)鮮美，含有豐富蛋白質(zhì)、氨基酸、?；撬帷⒕S生素和礦物質(zhì)等，具有增強(qiáng)雄激素、增強(qiáng)免疫力、降血糖等功效，具有很好的食療價(jià)值[4-6]。近幾年來國內(nèi)已有研究報(bào)道，牡蠣粗提取物具有抑瘤、增效、減毒的作用[7-8]。而牡蠣酶解物(oyster enzymatic hydrolysate，OEH)是對牡蠣肉進(jìn)行酶解、濃縮冷凍干燥后獲得，不僅含有分子質(zhì)量<1 000 Da的寡肽——牡蠣低聚肽(oyster oligopeptides，OOP)，而且含有豐富的氨基酸和牡蠣多糖、礦物質(zhì)等成分。由于寡肽可以不經(jīng)消化迅速被吸收，比游離氨基酸吸收率更高，且寡肽是介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的結(jié)構(gòu)功能片段，因此牡蠣低聚肽與自然牡蠣蛋白相比，不僅具有較高的生物活性，而且吸收率更高[9-10]。研究證明，牡蠣低分子活性物質(zhì)不僅能夠抑制肺腺癌A549 細(xì)胞生長率達(dá)62.2%，而且能有效抑制人胃腺癌BGC-823 細(xì)胞增殖活動[11-12]。為了研究OEH補(bǔ)充對肺癌增長的抑制作用并了解其機(jī)制，在建立小鼠Lewis肺癌模型的同時(shí)，按照低、中、高3種劑量給小鼠補(bǔ)充OEH，觀察并測量荷瘤小鼠的腫瘤體積，5周后進(jìn)行取材，稱量腫瘤質(zhì)量，觀察腫瘤組織的結(jié)構(gòu)，并測定肺癌組織中肺癌細(xì)胞的凋亡率、壞死率，血液中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells，NK)細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)的百分比，為OEH在臨床輔助治療腫瘤提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡蠣肉，北京中食海氏生物技術(shù)有限公司提供；細(xì)胞色素C(分子質(zhì)量12 500 Da)、桿菌酶(1 450 Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(451 Da)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(189 Da)4種分子質(zhì)量肽標(biāo)準(zhǔn)品、甲醇(色譜純)、三氯乙酸等，Sigma公司；小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株LL/2，美國菌種保藏中心，由上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司提供；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS),美國Hyclone公司；DMEM,Sigma-Aldrich公司；2.5 g/L胰酶、臺盼藍(lán)染色細(xì)胞存活檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；CD3、CD4、CD8、NK、CD25、CD127等熒光抗體以及Annexin V-PE/7-AAD凋亡檢測試劑盒，BD公司提供；雄性C57BL/6J小鼠,揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，許可證號：SYXK(蘇)201600019。

1.2 儀器和設(shè)備

UV22100紫外分光光度計(jì),優(yōu)尼柯(上海)儀器有限公司；QSY-Ⅱ型凱氏定氮儀，北京強(qiáng)盛分析儀器儀器制造中心；LC-20A高效液相色譜儀,SHIMADZU公司；835-50型氨基酸分析儀,HITACHI公司；Heraeus CO2培養(yǎng)箱,德國Heraeus(賀力氏)；Cyto FLEX流式細(xì)胞分析儀,Beckman；BX53熒光倒置顯微鏡,OLYMPUS。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 OEH的制備

將1 kg鮮牡蠣肉用攪拌機(jī)攪碎，用蒸餾水定容至3 L，沸水浴1 h后，降至室溫，以3 000×g離心處理5 min。將沉淀加入500 mL蒸餾水，攪拌均勻后，用NaOH調(diào)整pH至7.0，放入水浴中，升溫至50 ℃。按每100 g原料加入20 000 U的酶量加入中性蛋白酶，酶解1 h后，再按每100 g原料加入32 000 U的酶量加入木瓜蛋白酶，繼續(xù)酶解2 h。然后100 ℃滅酶15 min。冷卻后，3 000×g離心10 min，取上清液。將上清液過100目篩后，利用噴霧干燥器進(jìn)行干燥，最終得到牡蠣酶解物干粉。

1.3.2 OEH 組成成分的測定

采用凱氏定氮法(GB 5009.5—2016)測定總蛋白含量[13]；三氯乙酸法測定酸溶蛋白含量[14]；氨基酸自動分析法(GB 5009.124—2016)測定游離氨基酸的組成和含量[15]；高效液相凝膠色譜法測定分子質(zhì)量的分布范圍[16]；菲林試劑法測定總糖含量[17]；灼燒法(GB 5009.4—2016)測定灰分[18]；常壓干燥法(GB 5009.3—2016)測定水分[19]。

1.3.3 Lewis肺癌小鼠模型的建立

6周齡清潔級雄性C57BL/6J小鼠 48 只，體質(zhì)量(20±2)g，分籠飼養(yǎng)，每籠12只，環(huán)境溫度(23±2)℃，采用自然光照，自由飲食和飲水。

取小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株LL/2，放入含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)液中，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長完全融合，按1∶3的比例[將一瓶細(xì)胞(10 mL)分成3瓶(10 mL/瓶)進(jìn)行培養(yǎng)]傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)2.5 g/L胰酶消化后以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，加入生理鹽水制成細(xì)胞懸液。臺盼藍(lán)染色法測定活細(xì)胞數(shù)>95%，調(diào)整細(xì)胞濃度至6×106/mL，接種于C57BL/6J小鼠右前肢腋窩皮下，每只0.2 mL，全程嚴(yán)格無菌操作，40 min內(nèi)完成。Lewis肺癌小鼠模型建立后，觀察其成瘤情況，每周固定時(shí)間用游標(biāo)尺測量瘤的長徑(L)和短徑(W)，并用公式V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤體積。

1.3.4 動物分組及其干預(yù)方案

小鼠接種Lewis肺癌細(xì)胞株LL/2 24 h后稱重、編號，隨機(jī)分為荷瘤對照組(C)、荷瘤+低劑量OEH干預(yù)組(LOEH)、荷瘤+中劑量OEH干預(yù)組(MOEH)和荷瘤+高劑量OEH干預(yù)組(HOEH)，每組12只。除了C組在肺癌細(xì)胞接種后，每天灌服9 g/L生理鹽水外，LOEH、MOEH和HOEH組在肺癌細(xì)胞接種后，分別每天按照0.8、1.8和2.5 g/kg的劑量灌服OEH，共5周。

1.3.5 實(shí)驗(yàn)取材和樣本處理

取材前禁水禁食8 h，按照體質(zhì)量(0.02 mL/g)用36 g/L的水合氯醛進(jìn)行麻醉，用鑷子輕輕摘除眼球進(jìn)行眼窩取血，血液裝于含有肝素的EP管中，輕輕搖勻。然后速取腫瘤組織，準(zhǔn)確稱量質(zhì)量后分為3份，一份迅速放入體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛溶液中固定，一份放入凍存管內(nèi)迅速投入液氮，而后置于-80 ℃冰箱保存待測，另一份迅速制成腫瘤細(xì)胞懸液進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的檢測。

1.3.6 指標(biāo)的測定

1.3.6.1 存活率的計(jì)算

每天記錄小鼠的存活情況，5周后按式(1)計(jì)算各組小鼠存活率：

(1)

1.3.6.2 抑瘤率的計(jì)算

計(jì)算C、LOEH、MOEH和HOEH4組的平均瘤質(zhì)量，按公式(2)計(jì)算各組的抑瘤率：

(2)

1.3.6.3 肺癌細(xì)胞的凋亡和壞死數(shù)量的檢測

在相同位置取適量的肺癌組織，在平皿中用PBS緩沖液洗滌3次后，用無菌眼科剪將腫瘤組織剪碎，2.5 g/L胰酶消化，經(jīng)300目濾網(wǎng)過濾成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞調(diào)整到5×105/mL左右，取100 μL放入流式管中，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次(2 000 r/min 離心 5 min)，加入50 μL的Binding Buffer和5 μL 7-AAD染液，混勻，室溫、避光、反應(yīng) 15 min后再加入450 μL的Binding Buffer和1 μL Annexin V-PE混勻，室溫、避光、反應(yīng)15 min后上機(jī)檢測。

1.3.6.4 肺癌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察

常規(guī)制作肺癌組織的石蠟切片，在顯微鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，并拍照。

1.3.6.5 血液中T細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞數(shù)量百分比的檢測

取小鼠外周抗凝血200 μL置于流式管中，加入2 mL，1×紅細(xì)胞裂解液混勻，避光孵育15 min后，300×g離心5 min，棄上清液，加入1 mL PBS緩沖液重懸，300×g離心5 min后棄上清液，加100 μL PBS緩沖液重懸，得到外周血單核細(xì)胞懸液。加入CD3/CD4/CD8/NK抗體，避光孵育20 min。加1 mL PBS緩沖液重懸，300×g離心5 min，棄上清液后，加入200 μL PBS緩沖液，采用Cyto FLEX流式細(xì)胞分析儀檢測。

1.3.6.6 血液中Treg細(xì)胞數(shù)量的檢測

取小鼠外周抗凝血200 μL置于流式管中，加入2 mL，1×紅細(xì)胞裂解液混勻，避光孵育15 min后，300×g離心5 min，棄上清液，加入1 mL PBS緩沖液重懸，300×g離心5 min后棄上清液，加100 μL PBS緩沖液重懸，得到外周血單核細(xì)胞懸液。加入CD4/CD25/CD127抗體，避光孵育20 min。加1 mL PBS緩沖液重懸，300×g離心5 min，棄上清液后，加入200 μL PBS緩沖液，采用Cyto FLEX流式細(xì)胞分析儀檢測Treg(CD4+CD25+CD127-)細(xì)胞數(shù)量。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對C、LOEH、MOEH和HOEH組采用單因素方差分析和多重比較，P<0.05，表示差異具有顯著性，P<0.01，表示差異具有極顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 OEH的組成成分

由表1可知，OEH的總蛋白含量為57.23%，酸溶蛋白含量為52.12%，酸溶蛋白占總蛋白含量的91.07%?？偺呛?5.89%、游離氨基酸的含量為6.16%。由于小分子的肽類物質(zhì)和游離氨基酸可以溶于酸性溶液[16]，因此在OEH中，小分子低聚肽的含量約為45.96%。通過HPLC分析了OEH的相對分子質(zhì)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OEH相對分子質(zhì)量<1 000 Da的有91.92%，表明OEH的主要成分不僅含有小分子低聚肽，而且含有豐富的牡蠣多糖等物質(zhì)。有研究證明，分子質(zhì)量<1000 Da的低聚肽多為二肽和三肽[16]，相比于蛋白質(zhì)和游離氨基酸具有較快的吸收速度[20]，且牡蠣多糖可不經(jīng)消化就能吸收[21]，因此，可以推論OEH具有良好的吸收效率。

表1 OEH的基礎(chǔ)成分和分子質(zhì)量分布Table 1 Basic composition and molecular weightdistribution of OEH

2.2 OEH對小鼠皮下Lewis肺癌生長的抑制作用

雖然牡蠣低聚肽具有多種生理功能，但對腫瘤抑制效應(yīng)的研究并不多見。有研究發(fā)現(xiàn)，從牡蠣分離提取出來的牡蠣天然低分子多肽BPO-L不僅能夠有效抑制人肺腺癌A549 細(xì)胞增殖活動[22]，而且改變?nèi)朔蜗侔〢549細(xì)胞的惡性形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)特征[23]，對肺癌細(xì)胞具有顯著的誘導(dǎo)分化作用。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然OEH對肺癌的體積沒有顯著的效應(yīng)(F=1.168，P=0.348)，但是隨著OEH劑量的增加，肺癌體積降低的趨勢越明顯。OEH對荷瘤小鼠肺癌質(zhì)量的降低具有顯著的效應(yīng)(F=3.636，P=0.032)，劑量越高，降低肺癌質(zhì)量效果越明顯(表2和圖1)。采用多重比較分析發(fā)現(xiàn)，與C組相比，HOEH和MOEH組肺癌質(zhì)量顯著性降低(P=0.007，P=0.013)，LOEH組肺癌質(zhì)量有所降低，但沒有顯著性差異(P=0.082)。小、中等和高劑量OEH對荷瘤小鼠皮下腫瘤抑制率分別達(dá)到22%、29%和36%。雖然MOEH組小鼠5周存活率達(dá)到67%，但是OEH的補(bǔ)充對荷瘤小鼠的 5 周存活率沒有顯著的效應(yīng)(χ2=2.254，P=0.521)。從而進(jìn)一步說明，中、高劑量的OEH對荷瘤小鼠肺癌的增長具有顯著的抑制效應(yīng)，但不能顯著提高荷瘤小鼠的5周存活率，其原因還有待進(jìn)一步研究。

表2 各組小鼠肺癌重量、抑瘤率及5周存活率的變化Table 2 Changes of lung cancer weight, tumor inhibitionrate and 5-week survival rate in each group of mice

注：C、LOEH、MOEH和HOEH組進(jìn)行多重比較，與C組相比，*，P<0.05，**，P<0.01(下同)

A-C組；B-LOEH組；C-MOEH組；D-HOEH組(下同)圖1 各組小鼠的腫瘤Fig.1 Lung cancer from each group of mice

2.3 OEH對荷瘤小鼠肺癌組織細(xì)胞凋亡和壞死的促進(jìn)作用

細(xì)胞凋亡是一種程序性的細(xì)胞死亡，能將機(jī)體衰老和異常細(xì)胞及時(shí)清除。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展不僅與細(xì)胞過度增殖有關(guān)，而且與細(xì)胞凋亡的減少密切相關(guān)[24]。因此，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡已成為腫瘤治療的重要方法之一。李祺福等[22]從牡蠣體內(nèi)分離提取到牡蠣低分子活性多肽BPO-L通過減弱A549 細(xì)胞MTp53、c-myc等癌基因蛋白表達(dá)，增強(qiáng)p21WAF1/CIP1 和Rb等抑癌基因蛋白的表達(dá)，有效抑制A549 細(xì)胞增殖活動。本研究發(fā)現(xiàn)，OEH對荷瘤小鼠肺癌細(xì)胞的壞死率和凋亡率升高具有顯著的效應(yīng)(F=3.546，P=0.034；F=3.546，P=0.004)，OEH劑量越高，肺癌細(xì)胞壞死率和凋亡率升高效果越明顯(表3和圖2)。采用多重比較分析發(fā)現(xiàn)，與C組相比，LOEH組肺癌細(xì)胞的壞死率沒有顯著性增加(P=0.191)，凋亡率有極顯著性增加(P=0.001)；MOEH組肺癌細(xì)胞的壞死率和凋亡率均顯著性的增加(P=0.009、P=0.010)，HOEH組肺癌細(xì)胞的壞死率和凋亡率有顯著性增加(P=0.014、P=0.001)。同時(shí)從肺癌組織結(jié)構(gòu)上看(圖3)，C組肺癌組織內(nèi)細(xì)胞密集且排列整齊，肺癌組織內(nèi)毛細(xì)血管豐富，表明肺癌細(xì)胞生長旺盛且狀態(tài)良好，細(xì)胞核異染且清晰可見；LOEH組肺癌細(xì)胞呈現(xiàn)小片狀壞死；MOEH組和HOEH組可見其肺癌組織疏松，細(xì)胞排列不規(guī)則，可見不同程度的片狀壞死區(qū)，肺癌組織內(nèi)及其周圍微血管均較少。從而說明隨著OEH劑量的增加，肺癌細(xì)胞壞死區(qū)增大，且肺癌組織內(nèi)及其周圍毛細(xì)血管減少。因此，OEH不僅能有效促進(jìn)荷瘤小鼠肺癌細(xì)胞的凋亡，而且能有效促進(jìn)肺癌細(xì)胞的壞死，從而有效抑制肺癌的生長。

表3 各組小鼠肺癌細(xì)胞壞死率和凋亡率Table 3 Necrosis rate and apoptosis rate of lung cancercells in each group of mice

圖2 不同組別肺癌細(xì)胞壞死率和凋亡率Fig.2 Necrosis rate and apoptosis rate of lung cancercells in different groups注：UL區(qū)域的細(xì)胞為壞死細(xì)胞；UR區(qū)域的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞；LR區(qū)域的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞；LL區(qū)域的細(xì)胞為活細(xì)胞

圖3 各組小鼠肺癌組織HE染色(×400)Fig.3 HE staining in lung cancer tissues in eachgroup of mice

2.4 OEH對荷瘤小鼠免疫功能的提高作用

機(jī)體的免疫功能與肺癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，當(dāng)患者的免疫功能低下或受抑制時(shí)，肺癌的發(fā)病率增高；而在體內(nèi)腫瘤進(jìn)行性生長時(shí)，患者的免疫功能受抑制，兩者互為因果。外周血T 淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞能較好地反映機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)，在免疫調(diào)節(jié)和免疫耐受中發(fā)揮著重要作用[25]。其中NK 細(xì)胞可通過釋放穿孔素、顆粒酶等生物活性分子直接殺傷腫瘤細(xì)胞，是抵抗腫瘤生長的第一道防線；CD4+和CD8+ T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答在機(jī)體抗腫瘤免疫中也發(fā)揮非常重要的作用，CD4+ 細(xì)胞具有激活和增強(qiáng)免疫細(xì)胞毒T細(xì)胞和NK細(xì)胞的作用，CD8+是一種抑制性T 淋巴細(xì)胞，可刺激腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移[26-27]。Treg(CD4+CD25+)是一類具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)作用的T 細(xì)胞，在某些惡性腫瘤中，Treg水平升高可導(dǎo)致免疫功能混亂，促進(jìn)腫瘤生長，抑制抗腫瘤免疫效應(yīng)，同時(shí)腫瘤細(xì)胞可分泌TNF-β、IL-10 等抑制因子，誘導(dǎo)Treg分化，兩者相互作用，共同介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸[28-29]，而抑制Treg可以提高機(jī)體抗腫瘤能力[30]。研究表明，肺癌患者有不同程度的免疫功能受損，表現(xiàn)為CD3+、CD4+、NK 及CD4+ /CD8+顯著降低，而CD8+顯著增多(P<0.05)[31-32]。且T 淋巴細(xì)胞亞群水平與肺癌病情的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，肺癌病情越重，免疫狀況越差[33]。而牡蠣提取物[34]和牡蠣肽[35-37]對小鼠免疫功能有積極的調(diào)節(jié)作用，它不僅增加NK細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的功能，而且減輕和恢復(fù)環(huán)磷酰胺(cytoxan, CTX)誘導(dǎo)的低免疫應(yīng)答。雖然牡蠣提取物可提高荷瘤小鼠的免疫功能，特別是NK細(xì)胞活性，從而抑制小鼠肝癌和裸鼠體內(nèi)人結(jié)腸癌的生長[7, 38]，然而OEH對荷瘤機(jī)體免疫功能影響的研究報(bào)道并不多見。由表4、表5和圖4、圖5可知，OEH對荷瘤小鼠血液中CD4+T淋巴細(xì)胞百分比的升高和Treg細(xì)胞百分比下降具有顯著的效應(yīng)(F=9.808，P=0.000；F=9.792，P=0.000)，但對CD3+、CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞百分比以及CD3+/CD8+的增加無顯著的效應(yīng)(F=2.187，P=0.123；F=1.248，P=0.320；F=1.932，P=0.160；F=2.442，P=0.096)。經(jīng)過多重比較，與C組相比，LOEH組血液中CD3+百分比顯著性增加(P=0.024)；MOEH組CD4+T淋巴細(xì)胞百分比和CD4+/CD8+比值均顯著性增加(P=0.000、P=0.016)；HOEH組CD4+T淋巴細(xì)胞百分比顯著性增加(P=0.024)，且LOEH、MOEH和HOEH組血液中Treg 細(xì)胞百分比均顯著下降(P=0.000、P=0.000、P=0.008)。因此，OEH的補(bǔ)充能夠顯著降低荷瘤小鼠外周血中Treg 數(shù)量，一方面使同種同型或同種異型 CD4+CD25- 和CD8+T 細(xì)胞活化、增殖，引起荷瘤小鼠外周血中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量的增多；另一方面可以促進(jìn) NK 細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒作用，提高荷瘤小鼠的免疫功能，從而對肺癌的生長產(chǎn)生非常重要的抑制作用。但OEH提高荷瘤機(jī)體的免疫功的機(jī)制目前還不清楚，可能是由于OEH中含有豐富的寡肽一方面為淋巴細(xì)胞的增殖提供充足的氮源和能量，另一方可能寡肽中某些活性成分具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞的活化和分化，同時(shí)，OEH中豐富的牡蠣多糖也具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，提高免疫功能的作用[39-40]，具有抗腫瘤活性[40]，但其確切機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

然而，隨著OEH劑量的增加CD4+細(xì)胞數(shù)量有降低的趨勢，且HOEH組CD4+細(xì)胞數(shù)量顯著低于LOEH組(P=0.024)，Treg細(xì)胞數(shù)量有增加趨勢，但3組之間無顯著性差異。其結(jié)果與胡相卡等的研究相似，他們以從牡蠣肉中提取出來的多肽類物質(zhì)牡蠣素為研究對象，發(fā)現(xiàn)不同劑量的牡蠣素對小鼠的非特異性免疫、特異性免疫(細(xì)胞免疫和體液免疫)均有相應(yīng)的增強(qiáng)作用，隨著牡蠣素劑量的增加，小鼠機(jī)體免疫不斷增強(qiáng)，但增加到一定劑量時(shí)，小鼠機(jī)體免疫不再增強(qiáng)[41]。因此，在抗腫瘤時(shí)，OEH的適宜劑量還有待于進(jìn)一步研究。

表4 各組小鼠血液中T淋巴細(xì)胞百分比Table 4 Percentage of T lymphocyte in blood ineach group of mice

表5 各組小鼠血液中NK和Treg細(xì)胞的百分比Table 5 Percentage of NK and Treg in blood in eachgroup of mice

圖4 各組小鼠血液中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比Fig.4 Percentage of CD3+, CD4+, CD8+ T lymphocytesin blood in each group of mice

A,E-C組；B,F-LOEH組；C,G-MOEH組；D,H-HOEH組圖5 各組小鼠血液中NK和Treg細(xì)胞的分布圖Fig.5 Percentage of NK and Treg cells in blood in each group of mice注：a圖中小方格中的細(xì)胞為NK細(xì)胞；b圖中LR區(qū)域的細(xì)胞為CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞

3 結(jié)論與展望

本研究通過在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)了牡蠣酶解物能夠增加荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞功能，提高肺癌細(xì)胞的凋亡率和死亡率，從而顯著降低荷瘤小鼠肺癌的體積和質(zhì)量，且具有一定的劑量效應(yīng)，但以中、高劑量效果較好。然而牡蠣酶解物中的成分比較復(fù)雜，具有顯著抗腫瘤活性的具體成分以及牡蠣酶解物確切的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制目前還不完全清楚。因此，在后續(xù)的研究中如何分離純化牡蠣酶解物中具有顯著抗腫瘤活性的營養(yǎng)成分，并進(jìn)一步研究牡蠣酶解物的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，對于促進(jìn)牡蠣酶解物在抗腫瘤中的具體應(yīng)用具有非常重要的意義。