胡曉龍，王康麗，余苗，田瑞杰，范海報，孫繼祥，張軍，楊旭，馬歌麗，魏濤*

1(鄭州輕工業(yè)大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州， 450000) 2(河南仰韶酒業(yè)有限公司，博士后創(chuàng)新實踐基地，河南 澠池， 472400) 3(河南皇溝酒業(yè)有限責任公司，河南 永城， 476600)

窖泥是我國特有的環(huán)境樣品，是一種富含多種有機物(脂肪酸、醇、酯等)，具有高腐殖質(zhì)含量、高含水量及低含氧量等特性的特殊土壤[1-3]，棲息著大量厭氧菌群，如乳酸菌、產(chǎn)己酸菌及產(chǎn)甲烷菌等。窖泥微生物菌群是影響窖泥和白酒質(zhì)量優(yōu)劣的主要因素[4]，同時也是白酒釀造過程中重要的微生物來源，尤其是厭氧菌群[5]。

窖泥微生物的研究主要包括：(1)功能微生物分離及應用等。如自1964年“茅臺試點”以來，有諸多關于己酸菌的研究，其中吳衍庸等[6]率先從窖泥中分離出多株己酸菌(如ClostridiumLushun)并成功應用人工窖泥制備、窖泥養(yǎng)護等，大大縮短窖泥自然老熟時間及提升白酒品質(zhì)；近年來任聰?shù)萚7]通過差異性解析新老窖泥微生物菌群組成確定了窖泥中主體己酸菌為產(chǎn)己酸菌屬(Caproiciproducens)等；(2)群落多樣性解析。這主要是由于系統(tǒng)闡明濃香型窖泥中微生物群落α-及β-多樣性及其影響因素，對評估窖泥質(zhì)量和安全、揭示窖泥菌群代謝特征、控制和優(yōu)化群落結(jié)構(gòu)及深入探究其在白酒釀造過程中的發(fā)酵機制具有重要的理論及現(xiàn)實意義。由于高通量測序技術的廣泛應用[8]，不同窖齡、質(zhì)量、地理位置及窖池空間位置窖泥菌群組成、優(yōu)勢菌及痕量微生物已逐漸清晰，而且明確了pH、有效磷、含水量等是影響窖泥微生物菌群組成的重要理化因子[2,4,9-10]。但有關我國北方濃香型白酒主產(chǎn)區(qū)河南的窖泥微生物群落多樣性研究鮮有報道。鄭佳等[11]發(fā)現(xiàn)，窖泥香氣物質(zhì)含量與其所處窖池空間位置有關，如距窖口30 cm(上層)、120 cm(中層)、210 cm(下層)和240 cm(窖底)的窖泥香氣成分組成存在明顯的差異。TAO等[9]發(fā)現(xiàn)老窖池(≥25年)的窖底泥原核微生物群落趨于穩(wěn)定，但其中窖泥微生物群落的空間分布特征尚不清晰。

本文以河南某知名濃香型白酒企業(yè)的老窖池(35年)窖泥為研究對象，采用高通量測序技術全面解析窖壁上層、中層、下層和窖底窖泥原核微生物群落α-和β-多樣性；并基于冗余分析探究影響微生物菌群分布的理化因素，以期揭示窖泥原核微生物群落多樣性在老窖池中的空間異質(zhì)性及形成原因，為進一步探究不同位置窖泥對濃香型白酒釀造及風味物質(zhì)形成的具體影響和貢獻提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

窖泥樣品由河南某知名濃香型白酒企業(yè)提供；NaOH、酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、濃H2SO4、HCl、重鉻酸鉀、酒石酸鉀鈉、亞硝基鐵氰化鉀、高氯酸鈉、NH4Cl、酒石酸銻鉀、鉬酸銨、氟化銨、硼酸，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV BlueStar A紫外分光光度計，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；TGL-20M高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；PB-10 PH計，德國Sartorius公司；MP200A精密電子天平，上海良豐儀器儀表有限公司；101-1電熱鼓風干燥箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；DF-1集熱式恒溫磁力攪拌鍋，金壇市中大儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 窖泥樣品采集

對河南一家知名濃香型白酒企業(yè)的老窖池(35年)進行取樣，該企業(yè)濃香型白酒生產(chǎn)以多糧(高粱、小麥、大米、糯米、玉米)為原料，中高溫大曲為糖化發(fā)酵劑，采用固定配醅比例入池，混蒸混燒、泥窖固態(tài)續(xù)茬發(fā)酵方式，分層蒸餾，分段摘酒，分級儲存。隨機選取2口窖池，每口窖池選取窖壁上層(PW-T，距窖口垂直距離約0.3 m)、中層(PW-M，窖壁中心)和下層(PW-U，距窖底垂直距離約0.3 m)，以及窖底(PB)窖泥取樣；每層選取2個(距每層中心兩側(cè)0.3 m處)窖泥樣品并混勻作為該層代表性樣品，窖底泥代表樣品為窖底平面對角線交界點處窖泥和任一條對角線的一個四分位點處窖泥的混合物。即每口老窖池共取4個代表樣品，共計8個窖泥樣品。將每份窖泥樣品分為2份于-20 ℃冰箱保存，1份用于理化性質(zhì)分析，另1份用于高通量分析。

1.3.2 理化指標測定

參照李俊輝等[12]提出的烘干法和電位法分別測定窖泥含水量及pH。采用酸、堿中和滴定法測定總酸含量[13]。采用重鉻酸鉀氧化分光光度法測定乙醇含量[14]。采用靛酚藍比色法測定窖泥中氨態(tài)氮的含量[15]。參照NY/T 1121.7—2014行業(yè)標準測定窖泥中有效磷含量。

1.3.3 窖泥宏基因組提取及 Illumina Miseq 測序

利用Magen HiPure Soil DNA Kit試劑盒并參照說明書對窖泥樣品進行總DNA提取，然后用Qubit 2.0熒光定量儀測定其濃度和純度。將合格的DNA委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成建庫及Illumina MiSeq雙端測序。其中16S rDNA擴增子引物對為F：5’-CCTACGGRRBGCASCAGKVR VGAAT-3’和R：5’-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3’，擴增區(qū)域為16S rDNA的V3-V4區(qū)。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用Cutadapt(v1.9.1)、Vsearch(v1.9.6)及Qiime(v1.9.1)軟件對高通量測序序列進行質(zhì)控，包括序列拼接，以及去除含有 N 的序列、引物和接頭、質(zhì)量值<20的堿基、長度<200 bp的序列及嵌合體序列得到有效序列。使用 VSEARCH(v1.9.6)將有效序列進行聚類，其中相似性≥97%的序列歸為1個OTU。然后利用 RDP classifier (ribosomal database program) 貝葉斯算法對 OTU 的代表性序列進行物種分類學分析，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計每個樣本的群落組成?；?OTU得到分析結(jié)果，采用對樣本序列進行隨機抽平的方法，分別計算 Shannon、Chao1等α-多樣性指數(shù)反映群落的物種豐度和多樣性。采用軟件Canoco 5繪制RDA圖譜；SPSS 20軟件(IBM Corp., Armonk, NY)進行單因素方差分析(ANOVA)；Venn圖采用在線軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制；Heml軟件繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥樣品理化性質(zhì)

由表1可知，不同位置窖泥樣品的平均pH為5.43～8.66，與報道的正常窖泥及老窖泥的pH(5～7.61)具有一定的可比性，高于一般的新窖(1年)窖泥及退化窖泥(pH<4.5)[4,9,16-18]，說明本實驗所取窖池與老窖及正常窖池特征相似。從空間位置分析，窖泥含水量(35.8%～45.3%)、乙醇(10.6～20.4 mg/g FPM)、總酸(3.5～5.2 mg/g FPM)及有效磷(147.3～348 mg/kg FPM)含量隨窖壁深度增加基本均呈上升趨勢，pH(5.4～5.9)與銨態(tài)氮含量(593.1～419.6 mg/kg FPM)變化趨勢與之相反。但除了銨態(tài)氮和有效磷外，上述理化性質(zhì)在窖壁不同位置的窖泥樣品中不存在顯著差異(P>0.05)。與窖壁泥相比，窖底泥中pH、有效磷和銨態(tài)氮含量較高，且前兩者顯著高于窖壁上層窖泥(P<0.05)。由于pH和有效磷與微生物群落α-多樣性呈正相關[4]，因此推測窖底泥原核微生物群落物種豐度及多樣性均應高于窖壁上層窖泥。綜上，經(jīng)長期發(fā)酵，不同位置窖泥樣品理化性質(zhì)呈現(xiàn)一定的差異，這種差異可能是由不同位置窖泥與空氣接觸頻次、與黃水接觸程度、持水性差異、微生物組成差異等因素造成的[2]。

表1 窖泥樣品的理化指標Table 1 Physicochemical indexes of pit mud samples

注：FPM為新鮮窖泥；a,b代表不同位置窖泥樣品的理化性質(zhì)存在顯著性差異(P<0.05)

2.2 窖泥微生物群落α-多樣性

如圖1所示，當測序深度超過1萬條時，稀疏曲線進入平臺期。由于本研究測序深度(≥43 276條)遠大于1萬條且覆蓋率均超過99%(表2)，說明本次測序深度可覆蓋樣品中絕大多數(shù)微生物信息。

圖1 基于窖泥微生物群落Observed OTUs的稀疏曲線Fig.1 Rarefaction curves of pit mud microbialcommunity based on observed OTUs

由表2可知，上層窖泥物種豐度(Chao1指數(shù))及多樣性(Shannon指數(shù))均最低，窖底泥物種多樣性最高，但其物種豐度僅高于窖壁上層窖泥，中層和下層窖泥物種豐度較高，但其物種多樣性介于上層和窖底泥之間。對于窖壁泥來說，中層窖泥的物種豐度和多樣性高于上層和下層窖泥。此外，窖底泥均高于窖壁上層窖泥原核微生物群落物種豐度及多樣性，這也與上述理化性質(zhì)分析的推測結(jié)果一致。但整體上，不同位置窖泥樣品微生物群落OTU數(shù)量(249～305)、物種豐度Chao1(298.6～339.7)及物種多樣性Shannon(2.98～3.69)無顯著差異(P>0.05)，表明正常老窖池不同位置窖泥原核微生物群落α-多樣性差異不顯著(P>0.05)。我們推測這種現(xiàn)象主要是與窖泥pH有關，由于pH是影響環(huán)境微生物群落α-多樣性(Chao1、Shannon等)的主要因素，在一定的pH范圍內(nèi)(3

表2 窖泥樣品原核微生物有效序列數(shù)、豐度及α-多樣性指數(shù)Table 2 Effective sequence number, abundance and α-diversity index of prokaryotic microorganisms in pit mud samples

2.3 窖泥微生物群落β-多樣性分析

基于窖泥樣品OTU組成的層次聚類分析(hierarchical cluster analysis，圖2),將不同位置的窖泥劃分為2個簇，上層窖泥單獨聚為1簇(I)，其他3個位置的窖泥聚為另一簇(II)；第II簇又可以分為2個亞簇，下層窖泥和1個中層窖泥聚在第i亞簇，窖底泥和和另一個中層窖泥聚在第ii亞簇，表明窖池長期使用后其窖泥微生物群落呈現(xiàn)出明顯的空間異質(zhì)性，其中上層窖泥微生物群落變化程度要快于其他位置的窖泥。這可能是由于窖壁上層含水量低及有效磷含量低有關(表1)，張會敏等[2]和HU等[4]研究結(jié)果表明其均能顯著影響窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)。因此，進一步解析不同位置窖泥微生物群落(門、綱、屬水平)組成及理化因子對其影響有助于深入揭示窖泥微生物群落的空間異質(zhì)性及其形成的理化原因。

圖2 不同位置窖泥樣品的層次聚類分析Fig.2 Hierarchical cluster analysis of pit mudsamples in different locations

2.3.1 窖泥原核微生物門/綱水平組成

經(jīng)OTU注釋，所有樣品中共檢測到12個可鑒定門，包括11個細菌門及1個古菌門。如圖3-a所示，8個優(yōu)勢菌門(至少在2個樣品中含量均>1%的門)占每個樣品總含量的98.9%～99.9%，除軟壁菌門(Tenericutes，0.99%)外，其余優(yōu)勢菌門平均含量均大于1%。其中平均含量>2%的優(yōu)勢門分別為厚壁菌門(Firmicutes，71.1%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，16.3%)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes，5%)和廣古菌門(Euryarchaeota，2.1%)，其常以優(yōu)勢菌廣泛存在于四川[20]、安徽[21]和江蘇[4]產(chǎn)區(qū)的老窖泥、老熟窖泥或優(yōu)質(zhì)窖泥中。但本文窖泥中Euryarchaeota 的含量遠低于已報道的四川、安徽和江蘇產(chǎn)區(qū)的老窖泥或優(yōu)質(zhì)窖泥樣品(8.7%～27.6%)[4,9,21]，這可能是由窖泥的綜合理化性質(zhì)差異造成的，如該酒企的銨態(tài)氮或有效磷含量低于上述窖泥，其中銨態(tài)氮含量遠低于上述四川(≥3.55 g/kg)和安徽窖泥(≥2.96 g/kg)，而其有效磷含量明顯低于上述優(yōu)質(zhì)窖泥(805 mg/kg)，而這些理化因子含量與窖泥中Euryarchaeota含量呈極顯著的正相關[4,9]。Tenericutes在近老熟的窖泥中含量較高[22]，放線菌門(Actinobacteria)在老窖泥含量(50年，1.09%～7.58%)及類群(67個OTUs)均較新窖(1年和5年窖齡，0.34%～0.97%，54個OTUs)高或多[9,23]。Cloacimonetes為個別酒企老窖泥(25年)中的優(yōu)勢菌門。此外，Proteobacteria為新窖或退化窖泥優(yōu)勢菌門，在本文所用窖泥中的含量均很低(0.24%)。上述結(jié)果再次表明本文供試窖泥微生物群落組成特征與上述老窖泥相似。此外，目前Patescibacteria門在其他濃香型白酒主產(chǎn)區(qū)窖泥中鮮有報道，推測其可能為該酒企特有的優(yōu)勢菌門。

從空間分布來看，隨窖池深度增加，F(xiàn)irmicutes呈下降趨勢，其中PW-T窖泥Firmicutes(90.6%)顯著高于PB(54.4%，P<0.05)。Bacteroidetes和Tenericutes門呈波動趨勢，在PW-M和PB中含量較高，但無顯著差異。Synergistetes和Actinobacteria呈先升后降趨勢，在PW-U中含量最高，分別為11.8%和3%，并分別顯著高于PW-T中的Synergistetes及PB中的Actinobacteria含量。Euryarchaeota和Patescibacteria呈上升趨勢，且PW-T中Euryarchaeota顯著低于其他層次的窖泥。較之于窖壁泥(0.1%～0.2%)，Cloacimonetes主要存在于PB中(6.4%)。

在綱水平，共20個可鑒定綱，10個優(yōu)勢綱(至少在2個樣品中含量均>1%的綱，圖3-b)。含量超過2%的優(yōu)勢綱分別為梭菌綱(Clostridia，68.3%)、擬桿菌綱(Bacteroidia，16.3%)、互養(yǎng)菌綱(Synergistia，5%)和芽孢桿菌綱(Bacilli，2.3%)，占每個樣品的79.3%～97.6%，其中前2個綱是老窖泥、正常窖泥或優(yōu)質(zhì)窖泥中的含量較高的優(yōu)勢菌綱[4,9]。從空間位置來看，優(yōu)勢菌綱的分布情況與其對應門分布情況基本一致(圖3-a和3-b)，如Clostridia和Bacilli的變化規(guī)律與其對應的Firmicutes一致，呈下降趨勢；Bacteroidia(屬Bacteroidetes門)呈波動趨勢；Synergistia(屬Synergistetes門)呈先升后降趨勢且在PW-U中含量最高等。

2.3.2 窖泥原核微生物屬水平組成

共檢測到142個屬，其中上層窖泥屬數(shù)量最少(92個)，中層最高(120個)，下層(106個)和窖底泥(110個)介于兩者之間，與表2中OTU變化規(guī)律一致。Venn圖顯示特有屬數(shù)量在中層窖泥最多(17個，占總的50%)，但其在每類窖泥中的含量均很低(0.03%～0.2%，圖4)。不同位置窖泥共有屬數(shù)量共75個，每類樣品中含量均為98%左右，表明共有屬可能是老窖池窖泥中的重要微生物類群，其總含量不受空間位置影響。

a-門水平；b-綱水平圖3 窖泥原核微生物門和綱水平組成Fig.3 Composition of prokaryotic microorganisms in pit mudat the level of phylum and class注：“*”表示不同位置窖泥存在顯著差異(P<0.05)

圖4 屬水平Venn圖Fig.4 Venn diagram of microbial flora at genus level

將每個樣品中含量≥1%的屬定義為優(yōu)勢屬，共32個(圖5)，占每個樣品的83.3%～93.4%，包括24個可鑒定屬(71.8%)及8個未鑒定屬(17.5%)，表明該企業(yè)窖泥中可能蘊含著較豐富的特有微生物資源，菌群復雜[2]。優(yōu)勢菌屬隸屬于9個綱，主要集中在Clostridia(19個屬，總含量為61.4%)、Bacteroidia(6個屬，占16.0%)，其中12個屬在所有樣品中的平均含量≥2%(圖5中標記“**”的屬)，產(chǎn)己酸菌屬(Caproiciproducens，27.3%)最高，其次為Proteiniphilum(9.9%)。Caproiciproducens是我國濃香型白酒其他主產(chǎn)區(qū)(四川、安徽)老窖泥或正常窖泥的優(yōu)勢菌屬[7,16,21 ]；但乳桿菌屬(Lactobacillus)含量(2.3%)遠低于已報道的新窖(62.3%)和退化窖泥(91.5%)[4,9]，再次說明本研究供試窖池為正常老窖池。

熱圖進一步展示了32個窖泥優(yōu)勢屬空間分布差異(圖5)，其中上層窖泥含量最高的屬有10個、中層2個、下層6個和窖底14個。例如，上層窖泥中Caproiciproducens(45.6%)、氫孢菌屬(Hydrogenispora，5.5%)和Lactobacillus(6.1%)平均含量最高，其中Caproiciproducens屬隨窖池深度增加呈逐漸下降趨勢，Lactobacillus窖底泥含量最低。Fastidiosipila屬含量下層>窖底>中層>上層。沉積菌屬(Sedimentibacter)和互營單胞菌屬(Syntrophomonas)窖底泥含量>任何窖壁泥。甲烷短桿菌(Methanobrevibacter)和氨基桿菌屬(Aminobacterium)含量下層>中層>窖底>上層。發(fā)酵單胞菌屬(Fermentimonas)含量中層>下層>窖底>上層窖泥，等等。

圖5 基于優(yōu)勢屬的熱圖分析Fig.5 Heatmap analysis based on dominant genera注：“**”表示含量≥2%的屬

綜上，窖泥微生物群落組成存在明顯的空間異質(zhì)性，整體來說75%優(yōu)勢屬的含量在上層或窖底窖泥中最高；且相同位置窖泥之間也存在一定的差異(如2個PB樣品中Proteiniphilum含量差異較大等)。與之前關于不同位置(僅選2個位置，窖壁和窖底)窖泥的研究相比[2]，本研究采用高通量測序技術系統(tǒng)地解析了窖壁上層、中層、下層及窖底泥4個位置窖泥微生群落多樣性，有助于揭示窖泥微生物群落在老窖池中的空間分布規(guī)律。同時為不同位置窖泥的定向微生物強化，以及特有窖泥微生物資源的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)，如從富含未鑒定屬(Clostridiaceae_1_Un)的PW-U中篩選新的種屬。

如前所述，窖泥是一個以兼性(如Lactobacillus)和專性(如Clostridia綱中的屬)厭氧微生物為主要菌群的特殊且復雜的微生態(tài)體系[1,4]，且存在大量未知種屬。這種原核微生物群落復雜性和多樣性是窖泥菌群功能多樣性和魯棒性(指生物體抵抗外界擾動或自體內(nèi)部攝動的能力)的基礎。例如，Clostridia綱中Clostridiumspp.(ClusterI)能利用多種底物(簡單或復雜碳源、蛋白質(zhì)等)合成多種不同碳鏈長度脂肪酸(己酸、乙酸、丁酸和辛酸等)、醇類(己醇、丁醇和乙醇等)及CO2和H2等氣體，其中己酸衍生物(己酸乙酯)是濃香型白酒主體香，該屬是窖泥中較易篩選到的梭菌[8,24-26]，如C.kluyveri、C.carboxidivorans、C.sporogenes和C.tyrobutyricum等。Syntrophomonas屬(Clostridia：ClusterVIII)能將長鏈脂肪酸降解為乙酸和H2，可為氫或乙酸營養(yǎng)型甲烷菌提供底物[8-9]。Synergistia綱中的Aminobacterium屬能發(fā)酵氨基酸，如Aminobacteriumcolombiensegen能利用多種氨基酸(甘氨酸、絲氨酸等)，且與氫營養(yǎng)型甲烷菌共生時氨基酸底物譜擴大[27]；其代謝物銨態(tài)氮可為其他微生物生長繁殖提供氮源[2]。Sedimentibacter屬能將硫代硫酸鹽和元素硫還原為硫化物[28]。Bacteroidia 綱中的屬(如Proteiniphilum、Petrimonas和Fermentimonas等)能水解多糖、蛋白質(zhì)及發(fā)酵糖類生產(chǎn)乙酸和丙酸等脂肪酸，是一類生物質(zhì)厭氧消化的重要微生物類群[29]。此外，HU等[4]通過同現(xiàn)性網(wǎng)絡分析展示出窖泥不同微生物之間存在顯著正相關性，且Clostridia、Bacteroidia、Methanobacteria、Methanomicrobia及Synergistia等綱中的屬為窖泥復雜菌群網(wǎng)絡中的主要樞紐，其存在代謝關聯(lián)性。WANG等[5]通過微生物溯源(Source Tracker)分析發(fā)現(xiàn)酒醅原核菌群的14%來源于窖泥厭氧菌，如Petrimonas、Sedimentibacter和Syntrophomonas等屬。綜上，窖泥中微生物主要有4大主要功能：(1)窖泥微生物的高底物多樣性使其具有促進窖泥中的物質(zhì)(碳源、氮源及硫元素等)循環(huán)的能力；(2)窖泥微生物群落的復雜性(多樣性高)及其代謝關聯(lián)性有助于增強窖泥菌群的魯棒性及其網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；(3)為發(fā)酵過程中的酒醅提供重要的厭氧微生物菌群；(4)可為濃香型白酒提供重要的呈香物質(zhì)或其前體物質(zhì)(己酸、丁酸、辛酸及其相應乙酯等)，如Clostridia類群的代謝物。

2.4 窖泥理化因子與微生物群落的冗余分析(redundancy analysis, RDA)

窖泥理化因子是影響微生物群落α-及β-多樣性的重要因素[4,22]。冗余分析將32個優(yōu)勢屬大致分為4個類群(圖6-a陰影區(qū)域)，每個類群對應一類位置的窖泥(圖6-b)。結(jié)合熱圖分析(圖5)發(fā)現(xiàn)每個類群在其對應窖泥中的含量最高，例如圖6-a左上陰影區(qū)域的10個屬的含量均在PW-T中最高，右側(cè)陰影區(qū)域14個屬的含量均在PB中最高。窖泥因子對優(yōu)勢屬菌群結(jié)構(gòu)的總解釋貢獻度為71.4%(圖6-a和6-b)，其中Axis1軸占43.3%，可將窖壁泥和窖底泥較好地區(qū)分開；Axis2軸占28.0%能將窖壁泥(PW-T、PW-M和PW-U)區(qū)分開。但對優(yōu)勢屬菌群結(jié)構(gòu)的影響是多個理化因子的綜合作用，如PB與pH、有效磷和銨態(tài)氮呈正相關，與乙醇和總酸呈負相關；PW-T與多種理化因子呈負相關，尤其是含水量和有效磷等(圖6-b)。

a-優(yōu)勢屬;b-樣品圖6 基于冗余分析的環(huán)境因子分別與優(yōu)勢屬及樣品關系圖Fig.6 The relationship between environmental factors anddominant genera and samples based onredundancy analysis

條件限制分析(conditional term effects)揭示了每個理化因子對優(yōu)勢屬菌群結(jié)構(gòu)影響程度，其中pH(33.8%)和有效磷(20.1%)對菌群影響較大，然后依次為總酸(13.5%)>銨態(tài)氮(12.6%)>含水量(10.4%)，乙醇影響最小(6.3%)，且只有pH值與優(yōu)勢屬菌群結(jié)構(gòu)呈極顯著相關(P<0.01)，而其他因子均不顯著(P>0.05)。此外，相關研究表明pH、有效磷或銨態(tài)氮與老、優(yōu)質(zhì)窖泥呈顯著正相關，與退化窖泥呈顯著負相關[4,9]。綜上，pH、有效磷或銨態(tài)氮不僅是影響窖泥微生物菌群在不同窖齡和質(zhì)量窖泥中分布的主要理化因子，在一定程度還影響著其在正常老窖池中的空間分布，尤其是pH。

3 結(jié)論

河南作為我國濃香型白酒主產(chǎn)區(qū)之一，但關于其窖泥微生物群落α-及β-多樣性及其窖池空間異質(zhì)性研究鮮有報道。結(jié)合理化因子分析，本文對河南某濃香型白酒企業(yè)老窖池(35年)4個不同位置(窖壁上、中、下層和窖底)窖泥原核微生物群落多樣性進行了解析，結(jié)果均表明供試窖池特征與老窖池相似。群落α-多樣性(Chao1和Shannon)分析表明不同位置窖泥之間存在差異但不顯著(P>0.05)。該酒企老窖泥中共8個優(yōu)勢菌門，主要為Firmicutes(71.1%)和Bacteroidetes(16.3%)，并推測Patescibacteria可能為河南產(chǎn)區(qū)或該酒企特有的優(yōu)勢菌門。32個優(yōu)勢屬隸屬于9個綱，主要集中在Clostridia和Bacteroidia綱，其中Caproiciproducens屬含量最高。群落β-多樣性分析、層次聚類分析及Venn分析表明窖泥原核微生物群落組成具有明顯的空間異質(zhì)性。例如，4個菌門的含量在窖池空間分布存在顯著差異且75%優(yōu)勢屬的含量在上層或窖底窖泥中含量最高；窖泥微生物群落呈現(xiàn)出明顯的窖池空間異質(zhì)性，其中上層窖泥微生物群落變化程度要快于其他位置的窖泥；中層窖泥特有屬數(shù)量(17個)最多但含量很低(0.2%)等。RDA分析顯示pH和有效磷與窖泥菌群的相關性的解釋度最高，表明兩者可能是影響窖泥微生物群落窖池空間分布的主要理化因素。