王 蕾 夏 紅 羅玉輝 陳體輝 李 雪 凡利敏

早期宮頸癌預后較好，5年生存率在92%左右，原位癌甚至可達100%[1]，因此盡早通過篩查宮頸病變，建立科學有效的宮頸癌防治體系至關重要。液基薄層細胞學檢查(TCT)在宮頸癌篩查方面應用已有較長歷史，且通過涂片質量優(yōu)化，其診斷靈敏度獲得較大提升[2]；隨著人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染與宮頸癌之間因果關系的確立，而聚合酶鏈反應(PCR)實時熒光技術的出現(xiàn)也令病毒DNA鑒別的簡易性與精確性維持在較高水平[3]，故HPV分型檢查也成為宮頸癌篩查的重要環(huán)節(jié)，且與TCT聯(lián)用提高診斷準確性已被臨床所廣泛認同[4]。腫瘤異常蛋白(TAP)是近年來腫瘤領域研究的熱點，已證實與乳腺癌、肺癌、胃腸癌等病理進展機制之間存在密切聯(lián)系[5-7]，對此，本研究旨在分析外周血TAP、HPV分型診斷、TCT分別及聯(lián)合應用于宮頸癌篩查的可行性與診斷效能，現(xiàn)將取得成果作如下報告。

1 材料與方法

1.1 一般資料

對2019年1月至2019年3月期間，于我科確診的110例宮頸病變患者臨床資料進行回顧性分析。納入標準：陰道鏡檢查發(fā)現(xiàn)宮頸病變；年齡20～80歲；有性生活史；1周內完成宮頸組織活檢、外周血TAP、HPV分型檢查及TCT。排除標準：診斷出其他部位良惡性腫瘤或HPV感染；妊娠期女性；伴有盆腔嚴重感染；檢查前1周內有陰道用藥、物理治療史或3 d內有性生活、陰道沖洗史；既往存在婦科手術史?；颊呤軝z時年齡為24～75歲，平均(47.52±13.86)歲；初次性生活年齡16～23歲，平均(19.73±1.54)歲；孕次為1～7次，平均(3.28±0.74)次；產次為0～3次，平均(1.65±0.39)次。根據(jù)宮頸組織學活檢結果將7例宮頸癌患者、39例鱗狀上皮內高度病變(HSIL)患者納入危險組(n=46)，將37例鱗狀上皮內低度病變(LSIL)患者與27例慢性宮頸炎癥患者納入對照組(n=64)。

1.2 外周血TAP水平測定方法

常規(guī)采集患者空腹狀態(tài)下指尖血20 μl，均勻涂片≥2/3玻片長度，置于水平工作臺室溫18 ℃～25 ℃環(huán)境下自然風干；采用TAP檢測試劑盒(聯(lián)科生物MultiSciences公司提供)，按照試劑盒說明書指示，向玻片垂直滴加凝聚助劑3滴，形成3個斑點，自然風干；采用腫瘤異常蛋白監(jiān)測系統(tǒng)圖像分析儀(曼想科技公司提供)，通過顯微裝置觀察TAP凝聚形態(tài)，并定量計算其覆蓋面積。

1.3 HPV分型檢測方法

于患者月經干凈后≥3 d進行采樣，取截石位，以鴨嘴型窺器充分暴露宮頸，棉拭子輕輕擦去過多分泌物，置入一次性宮頸采樣刷，以宮頸外口為圓心，覆蓋宮頸外口轉化區(qū)及宮頸管內，施加適當壓力沿固定方向刷取5～10周，裝入細胞保存液徹底洗脫細胞，混勻后分裝至2個樣品管封存；其中1份樣品采用cobas 4800系統(tǒng)(羅氏Roche公司提供)自動執(zhí)行細胞裂解與DNA提取、純化，采用LineGene 9660熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(博日BIOER公司提供)擴增HPV與內質控β-goblin基因的目標DNA序列，使其目標DNA序列能夠與相應的熒光探針結合，不同亞型HPV DNA探針以不同熒光染料進行標記，通過實時監(jiān)測樣本的熒光信號確定其含有的HPV種類與載量，以循環(huán)閾值<40.0判定為對應亞型HPV陽性，高危型HPV涵蓋16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68共14種亞型，其余6、11、30、42、43、44等亞型則為低危型，≥2種HPV亞型陽性可提示混合感染。

1.4 TCT方法

以上述采樣獲得的另1份樣品管為標本，置入HQTCT-Thin Plus膜式全自動液基薄層細胞制片機(鴻琪HQ公司提供)，經由過濾、細胞富集、排液、吸附轉移制備為液基薄層涂片并在95%乙醇中固定，多次沖洗后通過蘇木素核染色、堿化、橙黃胞質染色后以中性樹膠封固，由科內高年資醫(yī)師在高倍鏡下進行判讀，參考Bethesda系統(tǒng)診斷標準(TBS)[8]，診斷結果分為：未見上皮內病變細胞或惡性細胞(NILM)、不典型鱗狀上皮細胞(ASC)、LSIL、HSIL及鱗狀細胞癌(SCC)。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 兩組患者外周血TAP水平及HPV分型檢查結果比較

危險組外周血TAP水平明顯高于對照組，而兩組HPV分型檢查各結果分布也存在明顯差異，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者外周血TAP水平及HPV分型檢查結果比較

2.2 兩組患者TCT結果比較

危險組TCT結果病變程度明顯較對照組更嚴重，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患者TCT結果比較(例，%)

2.3 診斷效能分析

外周血TAP篩查診斷宮頸癌ROC曲線截斷值為123.74 μm2，該指標聯(lián)合以HPV分型檢查、TCT篩查診斷宮頸癌ROC曲線AUC為0.892(95%CI=0.831～0.952)，明顯大于各項單篩檢查方案，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，敏感性為86.96%，特異性為79.69%，見圖1、表3。

圖1 各檢查方案篩查診斷宮頸癌的ROC曲線

3 討論

目前臨床推薦的治療策略中，LSIL與慢性宮頸炎癥多以隨訪觀察、物理治療等保守措施為主，病情具有可逆性，而HSIL惡變趨勢幾乎不可逆轉，與宮頸癌類似，需及時采取手術治療[9]，因此盡早通過篩查作出分級診斷對改善預后尤為關鍵。

既往臨床宮頸細胞學檢查多通過宮頸刮片進行采樣，一方面刮取細胞可能不具有檢測價值，部分細胞難以轉移至載玻片，另一方面制片過程中也可能由于操作原因令細胞發(fā)生變形，暴露在空氣中不易保存，處理不當時炎癥細胞、血細胞及粘性分泌物也將干擾讀片，存在較高漏診率[10]。自TCT推廣應用以來，采用宮頸細胞刷能采集面更廣且更均勻，通過保存液及程序化制片技術，極大提高細胞轉移效率與涂片質量，可將宮頸上皮內病變診斷靈敏度由38%提高至65%[11]。然而細胞學檢查歸根結底需在鏡下判讀，雖然診斷標準明確，但仍受到醫(yī)師主觀性的影響，可重復性欠佳，假陰性率仍較高。本研究中，危險組TCT結果病變程度顯著較對照組更嚴重，其篩查診斷宮頸癌的敏感性與特異性分別為50.00%、93.75%，這表明部分宮頸病變患者無法通過細胞學特征進行準確診斷，究其原因可能與HPV感染早期引起宮頸細胞形態(tài)變化不明顯有關。

高危型HPV感染宮頸移行帶基底層細胞是宮頸癌病理進展的必須因素，病毒復制到一定數(shù)量可通過修飾遺傳物質，上調表達E6、E7等蛋白，介導宮頸上皮細胞正常生命周期，破壞信號傳遞與免疫識別機制，從而誘發(fā)癌變[12]。HPV分型檢測是以其遺傳物質DNA為目標，通過PCR靶點優(yōu)選、靶點擴增、自動化實時檢測、選擇性擴增的過程，識別相應HPV復制情況，其精度較第二代雜交捕獲試驗檢測更為理想[13]，可便于臨床醫(yī)師精確判斷HPV感染亞型，及時作出跟蹤隨診，有效提高診斷效能。本研究發(fā)現(xiàn)，危險組HPV分型檢查各結果分部比率與對照組差異較大，其敏感性與特異性分別為78.26%、68.75%，提示HPV分型檢查盡管能有效識別感染，但由于特異性不足，可能導致部分患者因診斷高估病情而接受必要的陰道鏡活檢或過度治療，因此部分學者不建議30歲以下女性開展[14]。

表3 ROC曲線相關參數(shù)

注：AUC與聯(lián)合篩查比較，*為P<0.05。

腫瘤細胞發(fā)生惡變時，其內部諸如糖基轉移酶、糖苷酶等糖基化修飾酶類活性降低，細胞表面糖蛋白結構發(fā)生變化，N-聯(lián)聚糖分支增加，將TAP釋放進入外周循環(huán)系統(tǒng)，細胞黏附性降低，因而更易發(fā)生浸潤或轉移[15]。據(jù)相關文獻報道，外周血TAP檢出陽性但其他檢查項目均未發(fā)現(xiàn)腫瘤的患者在隨訪18個月后，發(fā)現(xiàn)有3.6%確診惡性腫瘤，因此尤其適宜于卵巢癌、宮頸癌等發(fā)病率高且起病隱匿的婦科腫瘤篩查，該指標可起到良好的早期預警作用[16]。TAP不同于傳統(tǒng)的血清腫瘤標志物，通常采集受檢對象少量末梢血于載玻片上開展檢測試驗，觀察其凝聚顆粒覆蓋面積進行診斷，早期定性研究發(fā)現(xiàn)其陰性結果多表現(xiàn)為雪花狀、樹枝狀或年輪狀的條帶聚集形態(tài)，顆粒之間存在網(wǎng)格狀花紋，而陽性結果則多以邊緣規(guī)整的類圓形、團塊狀聚集形態(tài)，周圍附有少量黑色顆粒[17]，試驗現(xiàn)象典型性強。本研究結果顯示，危險組外周血TAP水平明顯高于對照組，單篩宮頸癌截斷值為123.74 μm2，與以往研究中的121 μm2較為接近，且聯(lián)合HPV分型檢查、TCT篩查診斷宮頸癌的敏感性與特異性分別為86.96%、79.69%，ROC曲線AUC顯著增大，這說明外周血TAP能從細胞學、病毒學而外的角度窺探宮頸上皮細胞癌變情況，因此有較好的補充效果，有助于提高診斷效能，且該指標作為相較于血清腫瘤標志物更便于檢測，能在基層醫(yī)院推廣普及。許剛等[18]在宮頸癌同步放化療前后檢測外周血TAP也獲得相似結論，發(fā)現(xiàn)其水平與患者療效及預后密切相關，治療后TAP陽性率下降，而TAP陽性患者生存時間也顯著較短。

綜上所述，外周血TAP可對HPV、TCT宮頸癌篩查項目診斷信息作出補充，聯(lián)合應用具有較高診斷效能，可避免誤診與漏診，有較高臨床應用價值。