嚴(yán)江濤，常麗，張江江，黃思齊，潘根，李建軍，唐慧娟，李錚，張翠萍，趙立寧，李德芳

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙410205）

工業(yè)大麻（Cannabis sativa L.）屬蕁麻目，大麻科，大麻屬，一年生雌雄異株的草本植物，偶有雌雄同株。根據(jù)古籍記載和出土文物表明[1]，大麻是人類栽培利用最早的韌皮纖維作物之一，而中國是大麻的起源地，也是世界上栽培利用大麻最早的國家，野生品種分布廣泛，栽培種中的變種和品種最多，品種資源極為豐富。幾千年來，人類生活的衣食住行用等各個方面與大麻聯(lián)系密切，已被廣泛應(yīng)用于糧食、魚網(wǎng)、繩索、服飾等多個方面。大麻作為我國的原產(chǎn)作物之一，在世界上均有種植，可分為纖維用、藥用和籽用。大麻籽中含油量最高可達(dá)到36%，主要由不飽和脂肪酸組成。大麻花葉中含有四氫大麻酚（THC），曾一度受到世界范圍內(nèi)的嚴(yán)格管制。藥理研究表明，大麻中的主要活性成分是大麻素，目前已知的天然大麻素有110余種，其中四氫大麻酚（THC）、大麻二酚（CBD）是大麻中的主要化學(xué)成分，為大麻的次級代謝產(chǎn)物[2]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3-10]，目前，CBD（一種淡黃色樹脂或者結(jié)晶）是大麻產(chǎn)品中應(yīng)用前景最廣闊的一種提取物，具有抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、代謝和免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、保護(hù)心血管、抗菌等作用。

當(dāng)前，CBD的主要提取方法有熱回流提取法[11]、酶解法[12]、超聲輔助提取法[13]、超臨界 CO2萃取法[14]等。CBD是由大麻二酚酸（CBDA）脫羧轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，加熱對CBD含量有一定的影響；酶法和超臨界萃取法條件要求嚴(yán)格、成本高；相比之下，超聲輔助提取法最為簡便經(jīng)濟(jì)。常規(guī)分析方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[15]、氣相色譜法（GC）[16]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLCMS）[17]。但目前關(guān)于CBD的生物活性研究還不夠深入。因此，對工業(yè)大麻中CBD的提取、鑒定以及活性測定對加速其藥用進(jìn)程，具有重要意義。ElSohly等[18]對大麻葉中的化學(xué)成分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，共得到528種化合物。到目前為止，己經(jīng)從大麻葉中分離的化合物包括大麻酚類、萜類、黃酮類、多酚類、生物堿、多糖、有機(jī)酸等化學(xué)成分，其中大麻酚類含有大麻酚類化合物及其衍生物。目前，從大麻植物中分離得到的大麻素有70多種，主要有四氫大麻酚（THC）、大麻二酚（CBD）、大麻環(huán)萜酚（CBC）、大麻酚（CBN）、大麻萜酚（CBG）及其丙基同系物 THCV、CBDV、CBCV和 CBGV等，含有精神活性成分的THC和非精神活性成分CBD為大麻素的主要成分[4]。大麻除了具有抗炎癥作用外還有抗腫瘤、抗氧化、抗精神病及神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究采用單因素試驗(yàn)，通過檢測提取溶劑種類、提取時間、提取次數(shù)、提取料液比4個因素對CBD含量的影響，確定工業(yè)大麻中CBD的最佳提取工藝，建立CBD的高效液相分析方法，并采用酶聯(lián)免疫法測定CBD對黃嘌呤氧化酶、多酚氧化酶、ABTS自由基抑制率觀測其酶抑制活性和抗氧化能力，以期為CBD的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試品種“云麻7號”和“大麻CY”樣品采自湖南省長沙市望城坡中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所試驗(yàn)基地，自然陰干或高溫烘干至恒重、粉碎后經(jīng)100目篩選得到粉末待用；CBD標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇、無水乙醇、正己烷、乙酸乙酯均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；自由基清除試劑盒、酶抑制試劑盒購自南京建成生物科技有限公司。

KQ5200DV型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TD5離心機(jī) （長沙英泰儀器有限公司）；移液槍（德國艾本得股份公司）；電熱鼓風(fēng)烘箱（上海一恒有限公司）；Agilent1260高效液相色譜儀（安捷倫有限公司）；酶標(biāo)儀（美國博騰儀器有限公司）；0.45μm有機(jī)濾膜（津隆）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Water Xbrige（250mm×4.6mm i.d.，5μm）；流動相：0.1%乙酸溶液 ∶乙腈=（25∶75）；流速：0.8 mL／min；柱溫：25°C；進(jìn)樣量：10μL；檢測波長：220 nm。

1.2.2 大麻二酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取0.01 g大麻二酚標(biāo)準(zhǔn)品，以甲醇定容制成母液 （1 mg／mL），用移液槍分別移取1 mg／mL CBD甲醇溶液50μL、100μL、200μL、300μL、400μL加入到容量為5 mL的棕色容量瓶中，-10°C下保存定容至刻度待用。在1.2.1的液相色譜條件下進(jìn)樣分析，以CBD濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 初始提取條件下工業(yè)大麻中大麻素的提取

經(jīng)85°C干燥后的大麻花葉粉碎過100目篩，準(zhǔn)確稱取0.2 g（±20 mg）大麻葉粉末，以料液比為1∶35（g∶mL）加入甲醇溶劑7 mL，初始超聲輔助提取3 min，提取一次，靜置30 min，超速離心機(jī)4000 r／min下離心3min，移取所有的上清液至10mL容量瓶，甲醇定容，搖勻，用2.5mL一次性注射器吸取甲醇提取液過0.45μm有機(jī)濾膜至1.5 mL液相瓶備用。利用下列公式計(jì)算大麻葉中大麻二酚含量。

x：CBD含量（%）

c：測得樣品峰面積帶入工作曲線所得的濃度值（μg／mL）

v：溶劑體積（mL）

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 溶劑種類對CBD含量的影響

固定反應(yīng)條件為：料液比為1∶35（g∶mL），提取次數(shù)為2次，提取時間5 min，考察不同提取溶劑（乙醇、甲醇、正己烷與乙酸乙酯混合液V：V=9∶1）對大麻二酚含量（%）的影響。

1.2.4.2 提取時間對CBD含量的影響

固定反應(yīng)條件為：提取溶劑為甲醇，料液比為1∶35（g∶mL），提取次數(shù)為2次，觀察不同提取時間（3 min、5 min、10 min、15 min）對大麻二酚含量（%）的影響。

1.2.4.3 提取次數(shù)對CBD含量的影響

固定反應(yīng)條件為：提取溶劑為甲醇，料液比為1∶35（g∶mL），提取時間為5 min，觀察提取次數(shù)（1次、2次）對大麻二酚含量（%）的影響

1.2.4.4 料液比對CBD含量的影響

固定反應(yīng)條件為：提取溶劑為甲醇，提取時間為5 min，提取次數(shù)為2次，觀察料液比（1∶20、1∶35、1∶50）對大麻二酚含量（%）的影響。

工程結(jié)構(gòu)是工程管理專業(yè)基礎(chǔ)必修課程之一。然而由于該課程的知識體系的復(fù)雜性、抽象性和實(shí)踐性，使得傳統(tǒng)的授課方式——黑板板書和口頭講解已經(jīng)不能讓學(xué)生將相關(guān)知識掌握透徹。因此，如何有效解決工程結(jié)構(gòu)課程教學(xué)的這一問題，已成為工程結(jié)構(gòu)課程教學(xué)中的一個重要問題。

1.2.5 生物活性試驗(yàn)

1.2.5.1 黃嘌呤氧化酶（XOD）抑制試驗(yàn)

配制1mg／mL的黃嘌呤溶液底物并離心取上清液，配制1×10-6mol／L XOD溶液，移液槍移取1 mL蒸餾水、20μL XOD、1 mL黃嘌呤底物作空白對照加入到比色皿中，其次加入濃度為100μg／mL的 CBD甲醇溶液 xμL（x=20、40、60、80、100）、（1000-x）μL蒸餾水、20μL XOD、1 mL黃嘌呤底物于比色皿中，紫外動力學(xué)測定295 nm處溶液的OD值，設(shè)定動力學(xué)時長為80 s，分別讀取0 s、40 s、60 s的OD值。按下列公式計(jì)算出ΔA值，將空白對照的ΔA0保持不變，以加入樣品的體積為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

其中 ΔA1=A40S-A0S，ΔA2=A60S-A0S

1.2.5.2 多酚氧化酶（PPO）抑制試驗(yàn)

首先配制濃度為500μg／mL的L-DOPA溶液作為反應(yīng)底物，然后配制濃度為1mg／mL的絡(luò)氨酸酶溶液。移液槍分別移取0μL、900μL、950μL、980μL、1000μL、1010μL CBD液加入到比色皿中，再向比色皿中加入20μL絡(luò)氨酸酶和1980μL多巴胺底物，在波長為475 nm處測定吸光度，讀取0 s、200 s時的OD值，記錄下A0s，A200s時的OD值，按下列公式計(jì)算出各個濃度下的ΔA值。以加入CBD的體積為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制多酚氧化酶抑制活性曲線。

其中ΔA=A200s-A0s

1.2.5.3 ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)

配制ABTS原液（7 mmol／L的ABTS溶液與2.45 mmol／L等體積過硫酸鉀溶液混合）在室溫、避光條件下靜置孵育成ABTS儲存液，稀釋（約50倍）后使得OD734=0.7±0.02。用甲醇配制成10、60、100μg／mL不同濃度的大麻二酚溶液。取100μL樣品溶入2000μL ABTS工作液，振蕩混合，放置于暗處5 min測定OD734值，重復(fù)3次，取平均值，用超純水代替樣品作為對照。按下列公式計(jì)算樣品的ABTS自由基清除能力。

式中：A0為對照品的吸光度，A1為樣品的吸光度

2 結(jié)果

2.1 大麻二酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

以CBD質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，高效液相色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制CBD標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。由圖可知：CBD濃度與峰面積在10～100μg／mL之間存在良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=44.814x+14.125（R2=0.9995）。圖2為工業(yè)大麻花葉中大麻素成分的高效液相分離圖譜，CBD的保留時間為10.8 min。

圖1 大麻二酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of CBD

圖2 大麻二酚標(biāo)準(zhǔn)溶液系列色譜圖Fig.2 HPLC of CBD series

2.2 初始提取條件下大麻中大麻二酚的提取

利用公式計(jì)算大麻葉中大麻二酚含量發(fā)現(xiàn)：初始提取條件（料液比1∶35、提取溶劑甲醇、提取1次、超聲時間3 min）下，大麻二酚含量為0.15%±0.001%。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 溶劑種類對CBD含量的影響

在料液比為1∶35（g∶mL），提取次數(shù)2次，提取時間5 min條件下，觀察不同溶劑對CBD含量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正己烷：乙酸乙酯（9∶1）的提取效果略好于甲醇（圖3，綜合考慮色譜基線穩(wěn)定、雜質(zhì)效應(yīng)影響、試劑成本、試劑毒性及提取效率等因素，我們選擇甲醇作為CBD提取的最佳溶劑。

圖3 不同提取溶劑對CBD含量的影響Fig.3 Effects of different solvents on the content of CBD

2.3.2 提取時間對CBD含量的影響

用甲醇作為提取溶劑，在料液比 1∶35（g∶mL）條件下提取 2次，觀察提取時間（3 min、5 min、10 min、15 min）對CBD含量的影響。由圖4可知，不同超聲時間對CBD含量的影響較大，超聲10 min時CBD的提取效率最佳，含量最高。繼續(xù)延長超聲時間反而降低了CBD的含量。因此，超聲10 min為CBD提取的最佳條件。

圖4 不同提取時間對CBD含量的影響Fig.4 Effects of different extraction time on the content of CBD

2.3.3 提取次數(shù)對大麻二酚含量的影響

用甲醇作為溶劑，在料液比為1∶35（g∶mL），提取時間為10 min的條件下，觀察提取次數(shù)（1次、2次）對CBD含量的影響。結(jié)果見圖5。“云麻7號”和“大麻CY”第一次提取CBD的含量占各自提取總量的92%和95%，增加一次提取次數(shù)CBD含量僅有輕微增加，表明兩次提取便能充分得到工業(yè)大麻花葉中的CBD。

圖5 不同品種不同提取次數(shù)對CBD含量的影響Fig.5 Effects of different varieties and extraction times on the content of CBD

2.3.4 料液比對大麻二酚含量的影響

用甲醇作為溶劑，提取10 min，提取次數(shù)2次，考察料液比（1∶20、1∶35、1∶50）對CBD含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著料液比的增加，CBD的提取含量逐漸下降（圖6），推測相同質(zhì)量的大麻花葉使用的溶劑量的增多在一定程度上能抑制對CBD的提取。因此，1∶20的料液比為CBD提取的最佳選擇。

圖6 不同料液比對CBD含量的影響Fig.6 Effects of differentmaterial-liquid ratio on the content of CBD

2.3.5 方法驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證單因素分析的可靠性，采用上述最佳工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：優(yōu)化后大麻二酚成分得率的平均值為0.171%±0.004%，相對于初始提取條件下得率提高了14%。

2.3.5.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按2.3項(xiàng)方法對2 mL大麻提取液在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h的含量進(jìn)行測定，共6次，測得RSD為0.82%，表明提取液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。對提取液每隔24 h測定一次含量，共三次，測得平均RSD為6%，表明提取液隨時間延長穩(wěn)定性降低。

2.3.5.2 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取一定量處理過的大麻葉片6份，按照上述提取優(yōu)化條件，在1.2.1色譜條件下進(jìn)樣分析，測得大麻二酚峰面積，計(jì)算大麻二酚含量，RSD為1.8%，表明優(yōu)化方法重復(fù)性好。

2.3.5.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

向已知量的提取液中加入大麻二酚標(biāo)樣，定容至10 mL，在2.3的色譜條件下進(jìn)樣分析。結(jié)果表明平均加標(biāo)回收率為97.38%，RSD為1.5%，表明優(yōu)化方法準(zhǔn)確度高。

2.4 CBD體外生物活性分析

2.4.1 黃嘌呤氧化酶（XOD）抑制試驗(yàn)結(jié)果

由圖7、圖8可知，由40 s和60 s的抑制率曲線得到線性方程分別為：y=40.14x+3（R2=0.9479）；y=39.04x+9.94（R2=0.8873），計(jì)算得出 IC50（40s）為 1.18μg／mL，IC50（60s）為1.03μg／mL。CBD對黃嘌呤氧化酶的抑制能力隨著其質(zhì)量濃度的增加而增加，成正比例關(guān)系，與張晨輝[18]總結(jié)的藥用植物中黃嘌呤氧化酶抑制劑的研究進(jìn)展一文中各類藥用植物對比，大麻二酚對XOD的抑制活性大于沉香樹葉（1.35μg／mL）和荷葉總生物堿提取物（IC50為3.313μg／mL）以及其它各類中藥提取物（IC50為8.3～46.7μg／mL），說明CBD具有較強(qiáng)的黃嘌呤氧化酶（XOD）抑制能力。

圖7 40s CBD對XOD的抑制率曲線Fig.7 The surppression curve of CBD against XOD

圖8 60s CBD對黃嘌呤氧化酶抑制率曲線Fig.8 The surppression curve of CBD against XOD

2.4.2 多酚氧化酶（PPO）抑制試驗(yàn)結(jié)果

由圖9可知CBD對多酚氧化酶酶抑制活性線性方程為：y=10.012x+0.068（R2=0.9999），計(jì)算得到IC50為4.99μg／mL，CBD對多酚氧化酶的抑制能力類似黃嘌呤氧化酶的情況，其抑制能力隨著CBD質(zhì)量濃度的增加而增加，成正相關(guān)，表明大麻二酚具有較好的多酚氧化酶（PPO）抑制能力[19]。

圖9 CBD對多酚氧化酶抑制率曲線Fig.9 The inhibiting curve of CBD against polyphenol oxidase

圖10 CBD對ABTS自由基清除率曲線Fig.10 The clearance curve of CBD against ABTS

2.4.3 ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖10可知大麻二酚多酚氧化酶酶抑制活性線性方程為：y=28.605x+1.869（R2=0.9955），計(jì)算得出 IC50=1.68μg／mL，其抑制效果強(qiáng)于蝦青素對 XOD的抑制效果（IC50為1.84μg／mL）[20]。大麻二酚對ABTS自由基清除率隨著其質(zhì)量濃度的增加而隨之增加，成正比例關(guān)系，說明低濃度的大麻二酚清除ABTS自由基能力弱，抗氧化能力弱，高濃度的CBD對ABTS自由基清除能力較強(qiáng)，抗氧化能力強(qiáng)。

3 討論與結(jié)論

張愛芝等[21]通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（PLC-MS／MS）內(nèi)標(biāo)法測定食用油中痕量四氫大麻酚、大麻酚和大麻二酚。吳忠平等[22]采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）結(jié)合準(zhǔn)確質(zhì)量測定方法，利用保留指數(shù)、特征碎片豐度以及高分辨準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)據(jù)信息，快速鑒定樣品中的合成大麻素組分。本研究中，通過溶劑種類、提取時間、提取次數(shù)及料液比優(yōu)化工業(yè)大麻中大麻二酚（CBD）超聲提取工藝[24]；另外使用HPLC外標(biāo)法檢測大麻二酚（CBD）進(jìn)行方法驗(yàn)證，通過穩(wěn)定性、重復(fù)性及回收率試驗(yàn)建立大麻花葉中大麻二酚（CBD）的HPLC定性定量檢測方法。最后，通過對大麻二酚進(jìn)行XOD、PPO酶抑制和ABTS自由基清除試驗(yàn)對其活性進(jìn)行研究，表明大麻二酚具有一定的酶抑制活性和自由基清除能力。

采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化工業(yè)大麻中CBD的超聲提取工藝，其優(yōu)化條件為：溶劑為甲醇，提取時間10 min，提取次數(shù)2次，料液比為1∶20（g∶mL）。建立大麻中CBD的高效液相分析方法，在此優(yōu)化條件下通過驗(yàn)證試驗(yàn)測得CBD含量為0.171%±0.004%，相對于初始提取條件下的得率提高了14%，驗(yàn)證試驗(yàn)表明，該方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高（RSD=1.8%），加標(biāo)回收率高，平均回收率為97.38%（RSD=1.5%），適用于工業(yè)大麻花葉中CBD的定性和定量分析。

CBD的生物活性研究表明，CBD對 XOD、PPO、ABTS自由基的 C50分別1.18μg／mL（40s），1.03μg／mL（60s）、4.99μg／mL和 1.68μg／mL，CBD對 XOD、PPO具有一定的抑制能力，高濃度的CBD對ABTS自由基也具有很強(qiáng)的清除能力，說明CBD具有很大的藥用價(jià)值。該研究結(jié)果為大麻二酚的體外生物活性研究提供了前期基礎(chǔ)。