呂小青，劉林，薛建華，王彥平，李艷華，麻柱

（1.北京奶牛中心，北京 100192；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶牛遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100192;3.奶牛遺傳育種與繁殖北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100192）

早期胚胎丟失是奶牛繁殖失敗的主要原因之一，主要發(fā)生在胚胎附植前后，有多個(gè)因素影響胚胎丟失，如遺傳（SNPs、CNV等）、環(huán)境、疾病、病原微生物等都能引起胚胎死亡[1,2]。受精失敗引起的胚胎損失達(dá)17%，卵裂階段的胚胎損失達(dá)37%[3,4]。本研究篩選了兩個(gè)不同卵裂階段，對(duì)奶牛早期死亡胚胎進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于人類、小鼠、豬、牛等動(dòng)物研究中[5～7]，能快速地獲得樣本的序列信息和表達(dá)信息，具有高通量、全面等優(yōu)點(diǎn)，為研究基因表達(dá)調(diào)控的重要方法。本研究的目的是挖掘引起奶牛胚胎早期死亡的關(guān)鍵基因或突變，目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道，具體包括采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)奶牛8-細(xì)胞期和桑葚胚期死亡和正常的胚胎樣本進(jìn)行基因表達(dá)變化的分析，本研究分別針對(duì)奶牛胚胎的兩種不同時(shí)期進(jìn)行細(xì)胞組學(xué)測(cè)序，聯(lián)合分析不同時(shí)期胚胎之間的差異表達(dá)基因，獲得與奶牛胚胎發(fā)育相關(guān)的生物標(biāo)志物，為奶牛群體篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 體外胚胎的生產(chǎn)

屠宰場(chǎng)收集的卵巢通過(guò)保溫瓶運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，用10mL注射器采集卵母細(xì)胞。將鑒定可用的卵母細(xì)胞洗滌4遍后，放入成熟液滴中，成熟培養(yǎng)22～24h，并利用鮮精體外受精后，精卵共培養(yǎng)6～8h。之后將受精后的合子轉(zhuǎn)移到胚胎發(fā)育液滴中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為38.5℃、5% CO2、飽和濕度，期間每隔48h半量換液。

在受精88～96h后收集8-細(xì)胞階段正常胚胎和死亡胚胎，并在受精第6天時(shí)收集正常桑葚胚和死亡桑葚胚，提取RNA。胚胎發(fā)育階段和胚胎分級(jí)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)參考國(guó)際胚胎移植協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 cDNA文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

利用鏈霉蛋白酶將胚胎的透明帶消化掉，并利用玻針將單個(gè)卵裂球轉(zhuǎn)移至裂解液中，立即凍存于-80℃冰箱。之后對(duì)單個(gè)卵裂球進(jìn)行裂解，并反轉(zhuǎn)錄成1st cDNA。通過(guò)PCR擴(kuò)增富集、核酸純化、構(gòu)建文庫(kù)等之后，利用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序[8]，測(cè)序策略為PE 150。

1.3 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)處理

測(cè)序完成后，用 Casava1.8.2 軟件將圖像格式的測(cè)序數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為fastq格式，得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾獲得高質(zhì)量Clean Reads，再進(jìn)行后續(xù)分析，后續(xù)分析都基于Clean Reads[9,10]。本研究對(duì)獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)與?；蚪M參考序列（UMD3.1）進(jìn)行比對(duì)分析，采取HiSAT2軟件將各樣品過(guò)濾后的RNA-seq數(shù)據(jù)同基因組進(jìn)行比對(duì)分析，比對(duì)率達(dá)92%。每個(gè)組設(shè)置兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用DESeq2進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，并選取|log2Ratio|≥1和q＜0.05的基因作為顯著差異表達(dá)基因，從而獲得上下調(diào)基因個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 8-細(xì)胞期胚胎和桑葚胚表達(dá)譜變化

通過(guò)對(duì)奶牛8-細(xì)胞期和桑葚胚時(shí)期死亡和正常的胚胎樣本進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，聯(lián)合分析不同時(shí)期胚胎之間的差異表達(dá)基因，挖掘奶牛胚胎早期死亡的關(guān)鍵基因。

本研究設(shè)置了8-細(xì)胞期死亡組和正常組、桑葚胚死亡組和正常組，共4個(gè)組別，每組兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)，因此共建立了8個(gè)cDNA文庫(kù)，并且利用了Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。8個(gè)測(cè)序樣本共計(jì)獲得52、257、166條Reads，之后用DESeq2進(jìn)行差異基因分析，并選取|log2Ratio|≥1和q＜0.05的為差異顯著。

通過(guò)8-細(xì)胞期正常組與死亡組，桑葚胚期正常組與死亡組差異基因比較分析，獲得上下調(diào)基因個(gè)數(shù)。分析結(jié)果顯示，在8-細(xì)胞期獲得2倍以上差異表達(dá)基因157個(gè)，其中上調(diào)基因6個(gè)，下調(diào)基因151個(gè)；在桑葚胚期獲得2倍以上差異表達(dá)基因269個(gè)，其中上調(diào)基因10個(gè)，下調(diào)基因259個(gè)。

2.2 差異表達(dá)基因的GO統(tǒng)計(jì)

基因功能注釋（Gene Ontology，GO）可分為三個(gè)部分，分別描述基因的分子功能（Molecular Function，MF）、細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）、生物過(guò)程（Biological Process，BP）。本研究通過(guò)差異基因分析在CC分類中有14個(gè)條目表達(dá)差異，其中差異基因占比最大的是細(xì)胞部分，其次為細(xì)胞器；在BP分類中有18個(gè)條目表達(dá)差異，其中差異基因占比最大的是繁殖過(guò)程；在MF分類中有10個(gè)條目表達(dá)差異，其中差異基因占比最大的是結(jié)合，其次是催化活性。GO詳細(xì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1。

圖1 差異基因的GO統(tǒng)計(jì)柱狀圖

2.3 差異基因KEGG通路分析

本研究對(duì)8-細(xì)胞期正常胚胎和死亡胚胎的差異表達(dá)基因，進(jìn)行了KEGG通路分析，同時(shí)對(duì)桑葚胚期也進(jìn)行了KEGG信號(hào)分析，與胚胎早期死亡相關(guān)性較高的通路為細(xì)胞凋亡信號(hào)通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成通路。

3 討論

Shinji Sasaki等對(duì)日本和牛人工授精30～60d期間死亡的791個(gè)胚胎進(jìn)行了以CNV為變異類型的GWAS分析，發(fā)現(xiàn)定位到8號(hào)染色體上378 127到412 061bp位置的ANXA 10基因第2～6外顯子區(qū)域的拷貝數(shù)變化（CNV） 與胚胎死亡有關(guān)。這項(xiàng)研究確定了一種缺失型CNV，在奶牛中包含ANXA10，與人工授精后30～60d的胚胎死亡率相關(guān)[11]。

2011年，VanRaden等人利用北美58 453頭荷斯坦牛、5 288頭娟姍牛及1 991頭瑞士褐牛的50K Illumina SNPs基因型數(shù)據(jù)[12]，通過(guò)軟件（Findhap.f90 version2）將其轉(zhuǎn)化為單倍型數(shù)據(jù)，得到長(zhǎng)度小于75個(gè)標(biāo)記的單倍型，通過(guò)不同世代個(gè)體比對(duì)，發(fā)現(xiàn)11種群體頻率很高的單倍型從來(lái)沒(méi)有以純合的形式出現(xiàn)，然后進(jìn)行系譜分析，觀察其遺傳方式，并通過(guò)和具體繁殖性狀（SCR、妊娠率、死胎率）的關(guān)聯(lián)分析，推測(cè)出5種單倍型，當(dāng)其純合時(shí)，會(huì)導(dǎo)致早期流產(chǎn)或死胎。

本研究利用高通量測(cè)序?qū)?-細(xì)胞期、桑葚胚期的正常和死亡胚胎進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因的通路分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路差異極顯著。但是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)量大，下一步將利用定量PCR技術(shù)對(duì)獲得的差異顯著基因進(jìn)行驗(yàn)證，以進(jìn)一步獲得引起胚胎早期死亡的重要標(biāo)志基因。

本研究初步對(duì)早期死亡胚胎進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，為進(jìn)一步研究胚胎發(fā)育潛能和體外胚胎生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)，對(duì)提高胚胎生產(chǎn)效率具有重要意義。