劉心，彭清潔，郭愛珍,2，陳曦,2，陳穎鈺,3

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室，武漢 430070；3.湖北省獸醫(yī)流行病學(xué)國際科技合作基地，武漢 430070）

1 病例介紹

2018年3月26日，國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疾病控制研究室/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)反芻動疾病研究室收到一份死亡公牛樣本，待確診死因。

通過對畜主的問詢得知，該場位于河南省駐馬店市，死亡牛只為1頭夏南種公牛。該公牛2018年3月25日下午一切正常，26日早上5點突然死亡，病死原因不明。之后立即進(jìn)行解剖并將組織病料送檢。

2 病理學(xué)診斷

夏南種公牛尸體外表無明顯異常，心、肺、腎無明顯異常；肝臟有大量黑色病灶，切開有淤血點；脾明顯腫大，實質(zhì)如泥，結(jié)構(gòu)模糊；腸胃結(jié)合部有化膿病灶；膀胱表面有大量出血點（ 圖1）。

圖1 牛內(nèi)臟剖解圖

對各臟器進(jìn)行組織切片檢查，結(jié)果顯示：肝臟有出血性壞死；心臟淤血、水腫、傳導(dǎo)纖維變形；脾臟紅髓區(qū)充滿紅細(xì)胞，淋巴細(xì)胞稀少；腎小球管擴張、腎上皮組織壞死、變性；膀胱出血、壞死；腸淋巴小結(jié)形狀不規(guī)則，紅細(xì)胞顯著增多，淋巴細(xì)胞減少，呈壞死性腸炎；肺出血、腫大，呈漿液性肺炎；膽囊組織黏膜纖維性壞死（圖2）。

圖2 病理切片圖（×400倍）

3 細(xì)菌學(xué)檢測

3.1 組織觸片

剪取一小塊肝臟，取切片進(jìn)行觸片，并進(jìn)行革蘭氏染色。結(jié)果顯示肝臟存在有鏈球菌感染（如圖3所示）。

圖3 肝臟組織觸片及革蘭氏染色結(jié)果，箭頭所示為鏈球菌（×100倍）

3.2 細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定

取各組織樣品均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。對生長出來的陽性菌落提取基因組，進(jìn)行 16SrRNA PCR 擴增并進(jìn)行測序。結(jié)果顯示，肝臟、淋巴結(jié)、膀胱、腸、脾臟中存在有大腸桿菌感染；胃中有福氏志賀桿菌感染；淋巴結(jié)中有鏈球菌（如圖4所示）。

圖4 細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果（×100倍）

3.2.1 大腸桿菌的特性測定

3.2.1.1 血清型鑒定

為了確定大腸桿菌血清型，進(jìn)一步做了玻片凝集試驗，用參考血清因子鑒定所分離的大腸桿菌，結(jié)果顯示該大腸桿菌血清型為O158。

3.2.1.2 藥敏試驗

為確定最佳治療方案，對分離培養(yǎng)的大腸桿菌進(jìn)行紅霉素、慶大霉素、氟苯尼考、卡那霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星及四環(huán)素的藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)分離菌株只對慶大霉素和氟苯尼考敏感（表1）。

表1 大腸桿菌分離株的藥敏試驗結(jié)果

3.2.1.3 毒力檢測

將大腸桿菌分離株按2.0×108/mL、4.0×108/mL和8.0×108/mL分別接種小鼠，每只小鼠接種0.2mL，同時設(shè)立空白對照，觀察24h。2h后接種小鼠出現(xiàn)嗜睡、反應(yīng)遲鈍癥狀，4h后開始死亡，24h內(nèi)全部死亡。對照組無癥狀和死亡。死亡小鼠解剖發(fā)現(xiàn)肝臟、脾臟、腸內(nèi)容物呈深紅色，腹腔有積液（圖5）。將腹腔積液、肝臟、脾臟組織接種TSA、麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)，結(jié)果顯示能夠分離到大腸桿菌O158。

圖5 接種小鼠出現(xiàn)明顯病理變化

3.2.1.4 毒力因子鑒定

提取大腸桿菌基因組DNA進(jìn)行astA基因PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)其條帶大小約111bp。將PCR產(chǎn)物送測序公司測序，確定結(jié)果為astA型（圖6）。

圖6 大腸桿菌astA基因PCR擴增

3.2.2 鏈球菌特性鑒定

3.2.2.1 毒力測定

將鏈球菌分離株接種小鼠，劑量與大腸桿菌相同，結(jié)果24h內(nèi)小鼠死亡。

圖7 鏈球菌不同濃度攻菌死亡鼠：2.0（左）、4.0（中）、8.0（右）×108/mL,0.2mL/只

對死亡小鼠進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)肝臟、脾臟、腸內(nèi)容物呈淡紅色，腹腔有積液（圖7）。取小鼠組織到TSA平板上進(jìn)行細(xì)菌分離，分離到鏈球菌。

3.2.2.2 血清型鑒定

利用農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室的現(xiàn)有參考血清因子，未鑒定出鏈球菌的血清型。

4 結(jié)論

根據(jù)病原檢測結(jié)果，結(jié)合解剖、小鼠攻毒情況，診斷該死亡牛為腸致病性大腸桿菌0158和鏈球菌混合感染。

5 臨床處理方案建議

雖然利用常用的鏈球菌參考血清因子未鑒定出分離株的血清型，但經(jīng)過一系列的實驗室檢測與小鼠毒力試驗，確定該公牛的發(fā)病和病死原因是致病性大腸桿菌0158和鏈球菌混合感染。感染導(dǎo)致脾、肝、心等臟器的變性壞死，出現(xiàn)急性敗血癥性死亡。

結(jié)合藥敏試驗結(jié)果，對臨床防治方法建議如下：

（1）對于亞急性病例，治療參考藥敏試驗結(jié)果，用慶大霉素、氟苯尼考等藥物進(jìn)行抗菌治療，并輔以輸液等對癥治療法。

（2）預(yù)防本?。阂皇羌訌婏曫B(yǎng)管理，加強牛舍衛(wèi)生。避免皮膚和飼料被糞便污染，牛舍要徹底消毒。同時加強對食物和水源的管理，避免經(jīng)食物和水傳播腸出血性大腸桿菌。二是對犢牛采取有效防制措施：犢牛初生后在24h內(nèi)需獲得足量高質(zhì)量的初乳，在冬季和春季要避免冷應(yīng)激的刺激，以免影響免疫球蛋白的吸收；新生犢牛應(yīng)單獨飼養(yǎng)、不宜群養(yǎng)，應(yīng)保持清潔衛(wèi)生。