李俊虹，李映廷，陳 飛

（1） 云南省第一人民醫(yī)院檢驗科；2） 普外一科；3） 腎內(nèi)科，云南昆明 650032）

體腔液細胞學的常規(guī)檢查對各種積液性質(zhì)的初步判斷能夠提供非常重要的依據(jù)，對鑒別炎癥和非炎癥性積液、惡性和良性積液是一個基礎(chǔ)性的檢查項目，對臨床各種疾病的早期診斷、鑒別診斷及療效觀察具有重要的臨床意義[1-2]。目前體腔液細胞學的檢查采用傳統(tǒng)的手工鏡檢法，檢測結(jié)果的重復性和準確性差，漏檢率和誤檢率高[3]。近年來，體腔液細胞學的自動化檢測已廣泛應用于實驗室[4]。儀器種類繁多，但目前沒有統(tǒng)一的規(guī)范化標準，儀器法是否可以代替手工鏡檢法、儀器的性能驗證、標準化操作、質(zhì)量控制、復檢規(guī)則、報告的發(fā)放和解析等都是需要研究的重點[7-8]。臨床迫切需要實驗室檢驗醫(yī)師發(fā)放一份精確的、具有參考價值的體腔液細胞學檢驗報告。本研究的目的是以傳統(tǒng)手工法為參考方法，驗證儀器法是否可代替體腔液細胞學的檢查，結(jié)合顯微鏡觀察，對細胞性質(zhì)做出正確的判讀。研究高熒光參數(shù)值的高低與異常細胞、腫瘤細胞檢出的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2013 年5 月至2016 年12 月就診于云南省第一人民醫(yī)院門診以及住院患者體液標本198例，所有標本經(jīng)EDTA-K2 抗凝，年齡2～80 歲，男性122例，女性76例，其中胸水110例，腹水51例，關(guān)節(jié)液1 份，心包積液4 份，滑膜腔積液1份，腹膜透析液2 份，腦脊液29 份，回訪臨床病理最終確診為惡性積液的標本數(shù)87例，良性積液55例，結(jié)核積液36例，肝硬化腹水20例。每份標本確保2 mL，收到標本后立即檢測，不能及時檢測的標本放低溫（2～4℃） 保存。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑與儀器 萊卡相差顯微鏡、低速臺式離心機、SysmexXT-4000i 全自動血球分析儀、改良牛鮑氏計數(shù)板、20 μL 的微量吸管、血球分析儀器特定試劑、瑞氏染液、3%的冰醋酸。

1.2.2 全自動血球分析儀XT-4000i 儀器檢測 將收集經(jīng)到的體腔液標本于1 h 內(nèi)嚴格按照儀器標準化操作規(guī)程，選用XT-4000i 的體液模式下進行上機檢測，獲得體液有核細胞總數(shù)（TC-BF），白細胞總數(shù)（WBC-BF）、紅細胞（RBC-BF） 分葉核細胞（PMN（#%））、單個核細胞（MN（#%））、嗜酸性粒細胞（EO-（#%））、高熒光參數(shù)（HF-BF（#%）） 值。PMN（#%） 主要指中性粒細胞、MN（#%） 主要包括淋巴細胞和單核細胞，HF-BF（#%） 主要包括組織細胞和腫瘤細胞等異常的大細胞。

1.2.3 手工計數(shù)法 由取得技師資格證的三位操作人員采用雙盲法（以減少由于人為因素造成的誤差） 平行進行，嚴格遵照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》，在顯微鏡下分析標本有核細胞的總數(shù)。

1.2.4 顯微鏡檢查 把標本沉淀后吸出上面的液體丟棄，保留少量的液體，把管底的液體輕輕混勻，制成涂片，規(guī)格約為2.5×1.0 cm（長×寬），待手工制片自然干燥后，固定標本，用血球瑞氏染液按染血片的方法進行染色（瑞氏染液和緩沖液1:1 的比例染色），待染色的制片自然干燥后，用萊卡相差顯微鏡在低倍鏡下整片觀察涂片，觀察有核細胞的分布情況（特別是頭、體、尾部重點觀察），如制片上有核細胞有無結(jié)構(gòu)形態(tài)的異常、充分估計數(shù)量的多少，對發(fā)現(xiàn)形態(tài)巨大的、成團的、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松的、形態(tài)異常的有核細胞用油鏡辨認。分類有核細胞中單個核細胞、多個核細胞、間皮細胞、異常細胞所占的百分比。

2 結(jié)果

2.1 儀器性能驗證

根據(jù)體腔液標本有核細胞的濃度，把198 份標本分為四組：A 組，30×106/L（n=56），B 組，31～200×106/L（n=45），C 組，201～1 000×106/L（n=62），D 組，1001×106/L（n=35）。有核細胞計數(shù)分析顯示（表1、2），A 組儀器法CV%（11.32） 大于手工法CV%（5.63），說明儀器法精密度不如手工法的好，相關(guān)系數(shù)r 為0.537，表明儀器法和手工法計數(shù)有核細胞中度相關(guān)。而B 組、C 組、D 組的CV% （6.52、2.68、8.26），表明儀器法精密度好。特別是B 組、C 組變異系數(shù)值小，具有很好的精密度。B、C、D 組相關(guān)系數(shù)分別為0.962、0.984、0.942，表明B、C、D 組都具有很高的相關(guān)性。結(jié)果顯示:有核細胞計數(shù)濃度在31～200×106/L、201～1000×106/L、1001×106/L 時，其儀器檢測法性能良好，結(jié)果較為精準。在有核細胞計數(shù)濃度≤30×106/L，儀器法計數(shù)誤差大，不能代替手工法。

在有核細胞分類中，表3 顯示，A 組和D 組手工法和儀器法的檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義（A組F＜0.01，D 組F＜0.02），表明在低高濃度的標本中，儀器法的體液有核細胞分類結(jié)果與手工法不一致。B 組和C 組儀器法和手工法的檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義（B 組F＞0.06，C 組F＞0.08），表明在中濃度的標本中，全自動血球分析儀XT-4000i 有核細胞分類結(jié)果與手工法較一致。

2.2 高熒光參數(shù)檢測的意義

本研究根據(jù)HF-BF（#%） 值，將標本分為四組，分別為：HF-BF≤3%組56例，3%＜HF-BF≤10% 組39例、10% ＜HF-BF ≤20% 組73例、HF-BF＞20%組34例[38]。據(jù)本研究表4 顯示，10%＜HF-BF≤20%組所占的比例為45.34%，其中主要為增生、變形、異常的間皮細胞（58例，36.02%）；其次為HF-BF ≤3% 組 （56例，34.77%），其中主要為多核細胞和單個核細胞（38例23.6%）；3%＜HF-BF≤10%組的標本為39例和HF-BF＞20%組的標本為34例，其中主要為增生、變形、異常的間皮細胞，分別為（26例16.15%）、（19例11.80%），腫瘤細胞主要分布在10%＜HF-BF≤20%組、HF-BF＞20%組中，分別為（11例，6.83%）、（9例，5.59%）。

2.3 散點圖與高熒光參數(shù)的相關(guān)性

全自動血球分析儀XT-4000i 儀器DIFF 通道檢測獲得的散點圖和相差顯微鏡鏡檢結(jié)果從HF-BF ≤3% 組、3% ＜HF-BF ≤10% 組、10%＜HF-BF≤20%組、HF-BF≧20%組中選取一例標本，根據(jù)散點圖及鏡檢結(jié)果對從HF-BF＞20%組中選取的5例標本進行診斷和分析。見圖1～5。

標本1 類型：胸水。有核細胞總數(shù)明顯增高，分類PMN 占94.3%，PMN 熒光區(qū)有大量的細胞；鏡下可見大量中性粒細胞，此外可見破碎的細胞。病理結(jié)果未見腫瘤細胞。出院診斷：肺部感染伴胸水。

標本2 類型：胸水。有核細胞值增高，分類PMN 占72.9%，HF-BF%值為58.8%，鏡下可見組織細胞和增生、變性的間皮細胞。病理結(jié)果：未見腫瘤細胞。出院診斷：肺部感染伴胸水。

標本3 類型：胸水。有核細胞值明顯增高，MN%較高，HF-BF%值為6.9%，鏡下以淋巴細胞為主。病理結(jié)果：未見腫瘤細胞。出院診斷：肺結(jié)核胸水，胸膜炎。

標本4 種類：腹水。白細胞值較高，分類單個核細胞82.5%，高熒光參數(shù)值為15.3%，鏡下可見較多的腫瘤細胞。病理診斷：腺癌。臨床診斷：結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移。

標本5 種類：胸水。白細胞總數(shù)升高，分類中單個核細胞比例74.6%，高熒光參數(shù)比值為13.4%，顯微鏡下見到較多的組織細胞、間皮細胞、腫瘤細胞。病理診斷：腺癌。

表1 XT-4000i 與鏡下有核細胞計數(shù)結(jié)果比較Tab.1 XT-4000i was compared with the count results of nucleated cells under the microscope

表2 XT-4000i 與顯微鏡下有核細胞計數(shù)結(jié)果相關(guān)性比較Tab.2 Correlation between XT-4000i and nuclear cell count under microscope

表3 XT-4000i 與顯微鏡下有核細胞分類結(jié)果的比較（）Tab.3 Comparison of XT-4000i and the classification results of nucleated cells under the microscope（）

表3 XT-4000i 與顯微鏡下有核細胞分類結(jié)果的比較（）Tab.3 Comparison of XT-4000i and the classification results of nucleated cells under the microscope（）

表4 四組標本鏡檢結(jié)果與高熒光參數(shù)(HF-BF%)的比較［n（%）］Tab.4 Comparison of microscopic examination results and high fluorescence parameters (HF-BF%) in four groups ［n（%）］

圖1 HF-BF≤3%標本的儀器結(jié)果及顯微鏡結(jié)果（×100）Fig.1 Instrument results and microscope ×100 results of HF-BF≤3% specimens

圖2 HF-BF≥20%標本的儀器結(jié)果及顯微鏡結(jié)果（×100）Fig.2 Instrument results and microscope ×100 results of HF-BF≥20% specimens

圖3 3%＜HF-BF≤10%標本的儀器結(jié)果及顯微鏡結(jié)果（×100）Fig.3 Instrument results and microscope ×100 results of 3%＜HF-BF≤10% specimens

圖4 10%＜HF-BF≤20%標本的儀器結(jié)果及顯微鏡結(jié)果（×100）Fig.4 Instrument results and microscope ×100 results of 10%＜HF-BF≤20% specimens

圖5 HF-BF＞20%標本的儀器及顯微鏡結(jié)果（×100）Fig.5 Instrument results and microscope ×100 results of HF-BF＞20% specimens

3 討論

本研究以手工法為參考方法，對全自動血球分析儀XT-4000i 體液模式檢測體腔液標本分不同的濃度進行比對，表明自動化體液細胞檢測不能完全代替手工法，在體腔液細胞中、高濃度時，儀器法檢測結(jié)果精準，快速，可以解決手工法的費時費力，人為誤差等因素[5]。但在低濃度時，儀器法檢測結(jié)果精確度差，與手工法相關(guān)性不高，檢測結(jié)果誤差較大，特別是腦脊液標本，細胞濃度較低時，儀器檢測結(jié)果是錯誤的，儀器法不能代替手工法。有核細胞的形態(tài)分析應根據(jù)細胞散點圖的分布并結(jié)合顯微鏡下觀察[3，4，7]。高熒光參數(shù)值越高，檢出異常細胞及腫瘤細胞的可能性越大，但有極少數(shù)高熒光參數(shù)值很高的體液標本，顯微鏡下檢出的是變異的間皮細胞。所以高熒光參數(shù)值的高低與異常細胞的相關(guān)性還有待于進一步研究[6，10]。

儀器法檢測已廣泛應用于實驗室[8]，但目前沒有制定出一個規(guī)范的檢測要求，自動化體液細胞學檢測規(guī)范化應包括以下幾點： （1） 標本的要求：根據(jù)來源的不同，體液標本分為漿膜腔積液（胸腔、腹腔） 關(guān)節(jié)腔積液、心包積液、滑膜腔積液、肺泡灌溪液等。標本量通常為3～6ML，不低于2 ML，標本采集后立即送檢，在室溫下保存時間不超過1 h，在4℃情況下保存不超過6 h，如此可以避免細胞破損、退化和死亡，以保障檢驗結(jié)果的準確性，體液標本抗凝選用抗凝劑以EDTA-K2 為最佳，拒收有凝塊標本；（2） 儀器性能的驗證：任何體液細胞自動化分析的儀器都應該以手工法作為參考方法進行比對，對儀器的性能進行驗證，只有通過性能驗證的儀器才能作為檢測儀器；（3） 質(zhì)量控制：包括檢測前標本的采集要求、檢測中檢驗人員的規(guī)范化操作、儀器的規(guī)范化操作、檢測后結(jié)果的分析和報告的發(fā)放；（4） 復檢規(guī)則的制定：當有形態(tài)不規(guī)整細胞的標本應該進行顯微鏡復核，當XT-4000i 報警提示有核細胞檢測異常時應手工鏡下復核，當高熒光參數(shù)（HF） 散點圖報警出現(xiàn)異常時應該進行顯微鏡復核；（5） 報告的解讀和分析：結(jié)合臨床診斷、病理學診斷報告、腫瘤標記物檢測報告、生化檢驗報告綜合分析檢測結(jié)果，為臨床提供有價值的檢驗報告。