李珊珊，全宇航，龔玲俐，楊 會(huì)，浦勁宏，王忠慧

（昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院麻醉手術(shù)科，云南昆明 650118）

骨肉瘤（ostesarcoma，OS） 是青少年中第三常見的癌癥，15 歲以下兒童的年發(fā)病率為5.6/100萬[1]。微小殘留疾病的存在，可導(dǎo)致大面積手術(shù)切除后癌癥復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，是癌癥患者死亡的首要原因。這些殘留癌細(xì)胞的進(jìn)展取決于圍手術(shù)期多種協(xié)同的因素，其中包括麻醉技術(shù)及藥物對腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響。七氟烷對骨肉瘤的作用尚未闡明。筆者旨在探討七氟烷對骨肉瘤Saos2 細(xì)胞的影響，以盡可能減少麻醉相關(guān)的腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨肉瘤細(xì)胞株（Saos2 細(xì)胞）：購自昆明江宗生物科技有限公司，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所分子生物室提供。胎牛血清：購自BIOSHARP 公司，RPMI1640 培養(yǎng)基、cck-8 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。七氟烷購自江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司。劃痕實(shí)驗(yàn)采用ibidi 傷口愈合與細(xì)胞遷移插件。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)方法與分組

向人骨肉瘤Saos2 細(xì)胞中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，取出處于對數(shù)期生長的Saos2 細(xì)胞，配制成1×106cell/mL 細(xì)胞懸液，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別標(biāo)記為對照組（Control 組）、1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組。將要處理的Saos2 細(xì)胞放置于特制無菌密閉容器中，密閉容器進(jìn)氣口與七氟烷麻醉機(jī)連接，出氣口與氣體分析儀連接；對照組以相同流量的無菌過濾氧氣處理。每組處理相同時(shí)間各2 h，七氟烷處理完畢后，于密閉容器中取出細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以供進(jìn)行增殖、侵襲、遷移及凋亡能力的測定。

1.3 細(xì)胞增殖率檢測

采用cck-8 法。0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，接種至96 孔板內(nèi)，每孔接種2500 個(gè)細(xì)胞，空白孔內(nèi)只加入培養(yǎng)基和cck-8 溶液。過夜培養(yǎng)后按照實(shí)驗(yàn)分組做對應(yīng)處理。處理結(jié)束后24 h 每孔加入10 μL cck-8 試劑，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h 后酶標(biāo)儀450nm 波長下檢測吸光度（OD 值）。

1.4 細(xì)胞侵襲能力觀察

采用Transwell 小室實(shí)驗(yàn)。在上下室之間鋪上適宜濃度的基質(zhì)膠。取對數(shù)期生長的Saos2 細(xì)胞，進(jìn)行消化、離心配制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105cell/mL，每孔上室加入細(xì)胞懸液100 μL，下室加入500 μL 含F(xiàn)BS 培養(yǎng)液，接種后不同濃度七氟烷作用2 h 后培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。經(jīng)固定、染色、清洗后100 倍鏡下觀察拍照。每個(gè)小室隨機(jī)選取5 個(gè)視野，拍照并計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。

1.5 劃痕傷口愈合實(shí)驗(yàn)

0.25 %胰酶消化收集細(xì)胞，調(diào)整懸液濃度為2.5×104/mL，往ibidi 插件的左右孔中各加入100 μL 的細(xì)胞懸液。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至融合度達(dá)到90%～100%，小心的用鑷子將傷口愈合插件拔出，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗一次細(xì)胞，加入MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，不同濃度七氟烷作用2 h 后培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，于0 h、12 h 觀察傷口愈合情況。采用ImageJ 圖片分析軟件計(jì)算劃痕愈合率。

1.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

0.25 %胰酶消化收集細(xì)胞，接種至6 孔板內(nèi)，每孔接種105個(gè)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右時(shí)更換為MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，不同濃度七氟烷作用2 h，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后，用0.25 胰酶消化收集細(xì)胞，PBS 清洗兩次。用100 μL 流式凋亡結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，每管加入5 μL Annexin V 混勻，室溫避光孵育10 min。隨后每管加入5 μL PI 避光孵育5 min，用PBS 將液體補(bǔ)至1 mL 后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graph pad8.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料服從正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，組間比較采用單因素方差分析，有差異用Dunnettt檢驗(yàn)與對照組比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 cck-8 細(xì)胞增殖率檢測結(jié)果

對照組和1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組的細(xì)胞增殖率分別為 100%、91.72%±2.23%、86.36% ±2.56%、81.97% ±3.71%，七氟烷組細(xì)胞增殖率均低于對照組（P＜0.05）），且隨著七氟烷濃度的增加，抑制增殖作用增強(qiáng)，見圖1。

2.2 Transwell 小室細(xì)胞侵襲能力的比較

對照組和1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（105.6±13.0）、（68.4±15.8）、（59.2±7.8）、（36.1±6.7）個(gè)。七氟烷組穿膜細(xì)胞數(shù)較對照組均減少（P＜0.05），表明隨著濃度的增加，七氟烷抑制侵襲作用增強(qiáng)，見圖2～3。

圖1 各組Saos2 細(xì)胞增殖率的比較Fig.1 Comparison of the ratio proliferation of Saos2 cells among different groups

圖2 各組Saos2 細(xì)胞侵襲能力的比較Fig.2 Comparison of the invasion of Saos2 cells among different groups

圖3 各組Saos2 細(xì)胞侵襲能力的比較（×100）Fig.3 Comparison of the invasion of of Saos2 cells among different groups （×100）

2.3 劃痕傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對照組和1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組劃痕愈合率分別為86.27%±4.56%、59.71% ±2.34%、56.10% ±2.81%、23.42% ±7.13%。七氟烷組劃痕愈合率低于對照組，尤其以5.1%七氟烷組愈合率降低最為明顯（P＜0.05），見圖4、圖5。

2.4 各組細(xì)胞凋亡結(jié)果比較

對照組和1.7%七氟烷組、3.4%七氟烷組、5.1%七氟烷組凋亡率分別為2.47% ± 0.56%、12.71% ±1.34%、17.50% ± 2.81%、25.42% ±3.13%。七氟烷組凋亡率均明顯高于對照組，尤其以5.1%七氟烷組凋亡最為明顯（P＜0.05）。見圖6、圖7。

3 討論

圖4 各組Saos2 細(xì)胞劃痕傷口愈合率的比較Fig.4 Comparison of the ratio of wound healing of Saos2 cells among different groups

骨肉瘤（osteosarcoma，OS） 是骨組織最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，惡性度高，青少年多發(fā)。目前骨肉瘤的治療仍以新輔助化療和手術(shù)治療為主，5 a 生存率仍無明顯提高。隨著腫瘤學(xué)和麻醉學(xué)的研究進(jìn)展，人們越來越關(guān)注麻醉藥物及方式的選擇對腫瘤患者預(yù)后的影響。吸入麻醉藥七氟烷具有效能強(qiáng)、可控性好的特點(diǎn)，是目前臨床常用的全身麻醉藥。七氟烷除了全身麻醉作用外，還可以通過降低缺血再灌注損傷、減輕炎癥反應(yīng)，降低毛細(xì)血管通透性等起到多器官保護(hù)作用。研究顯示[2]，吸入麻醉藥物可以影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄，也可以通過作用于多種受體、離子通道及神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用。

圖5 各組Saos2 細(xì)胞劃痕傷口愈合率的比較（×100）Fig.5 Comparison of the ratio of wound healing of Saos2 cells among different groups （×100）

圖6 各組Saos2 細(xì)胞凋亡率比較Fig.6 Comparison of the ratio of apoptosis of Saos2 cells among different groups

圖7 各組Saos2 細(xì)胞凋亡率比較Fig.7 Comparison of the ratio of apoptosis of Saos2 cells among different groups

越來越多的證據(jù)表明，七氟烷可以直接作用于腫瘤細(xì)胞，與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。其可能機(jī)制主要包括血小板活化、誘導(dǎo)凋亡小體產(chǎn)生以及Ras/ERK、TGF/smad3 和PI3K/AKT 等信號(hào)通路的激活等。以往的研宄顯示，七氟烷可能通過降低XIAP、suvivin 基因的表達(dá)及激活caspase-3 基因而抑制肺癌A549 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。七氟烷還能夠抑制喉癌HEP-2 細(xì)胞和結(jié)腸癌sw620 細(xì)胞及HCT1116 細(xì)胞的增殖[4-6]。最新研究發(fā)現(xiàn)低濃度七氟烷可促進(jìn)原發(fā)性犬乳腺癌細(xì)胞的增殖能力，但對于轉(zhuǎn)移性的乳腺癌細(xì)胞表現(xiàn)為劑量濃度依賴性的抑制作用，認(rèn)為與七氟烷調(diào)控NET1 基因有關(guān)[7]。但在乳腺癌的臨床研究中七氟烷麻醉的患者并未表現(xiàn)出較差的預(yù)后[8]。七氟烷呈劑量依賴性的抑制慢性白血病干細(xì)胞/祖細(xì)胞的增殖能力，其機(jī)制是通過劑量依賴性的抑制Wnt/β-catenin 信通通路中b連環(huán)蛋白和c-myc 的表達(dá)[9]。另一研究表明七氟烷通過缺氧誘導(dǎo)因子促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在體外生長，可以增強(qiáng)卵巢癌和腎癌細(xì)胞的增殖能力[10]。最新研究表明吸入七氟醚可抑制卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)的小鼠慢性氣道炎癥，同時(shí)抑制氣道增厚，抑制杯狀細(xì)胞、平滑肌增生，抑制膠原沉積和纖維增生，從而減輕小鼠肺組織的氣道重塑[11]。

大量研究表明，七氟烷對腫瘤細(xì)胞的作用有細(xì)胞屬性，與七氟烷作用時(shí)間、濃度有關(guān)聯(lián)的。七氟烷臨床常用濃度為1%～5.1%。本研究結(jié)果顯示，低中高不同濃度七氟烷組細(xì)胞增殖率、穿膜細(xì)胞數(shù)以及傷口愈合率均低于對照組，以5.1%七氟烷組降低最為明顯，3.4%七氟烷組次之。表明不同濃度的七氟烷均能夠抑制Saos2 細(xì)胞增殖，侵襲及遷移能力，且濃度越高，作用越明顯。筆者在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同濃度七氟烷對骨肉瘤Saos2 細(xì)胞的作用表現(xiàn)為促進(jìn)凋亡，且與濃度呈正相關(guān)。但畢竟是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與臨床實(shí)際尚有很大的差距，七氟烷對骨肉瘤患者的影響以及術(shù)后長期預(yù)后、麻醉相關(guān)的腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等作用仍需進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。