王 璐，劉 勤，張紅宇，劉永輝

（1） 云南省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南昆明 650031；2） 昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，云南省腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，云南昆明 650118）

血塞通注射液是五加科植物三七的根莖經(jīng)加工制成的三七總皂苷配制成的滅菌水溶液，是在心腦血管疾病治療中發(fā)揮重要作用的中藥注射劑，其功能主治為活血祛瘀，通脈活絡(luò)[1-2]。用于中風(fēng)偏癱，淤血阻絡(luò)證。血塞通注射液的的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定三七總皂苷的含量應(yīng)為其標(biāo)示量的80.0%～120.0%，且規(guī)定了三七總皂苷的指紋圖譜相似度不得低于0.95[3]，但中藥的藥材來源廣泛、多變，制備工藝復(fù)雜，而且，中藥中含有多種活性成分具有多種多樣的藥理作用，如果僅控制或檢測(cè)評(píng)價(jià)少數(shù)成分，無法綜合客觀真實(shí)地反映藥品安全、有效的相關(guān)質(zhì)量問題。為保證每批藥品的有效性和安全性，有必要豐富和完善中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在完成藥品含量測(cè)定的基本要求外，有必要增加藥品生物活性測(cè)定，選擇原理明確的實(shí)驗(yàn)方法，選擇檢測(cè)指標(biāo)應(yīng)具備較強(qiáng)的客觀性和專屬性，應(yīng)該能夠充分體現(xiàn)藥品的的功能主治或藥理作用[4-5]。本研究中，筆者選取了工藝穩(wěn)定、質(zhì)量合格的3家企業(yè)6 個(gè)批號(hào)的血塞通注射液來進(jìn)行小鼠體內(nèi)血栓實(shí)驗(yàn)[6-7]、小鼠斷頭存活時(shí)間實(shí)驗(yàn)[6]、小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)[8]、小鼠游泳時(shí)間實(shí)驗(yàn)（抗疲勞實(shí)驗(yàn)）[8]，最終篩選出實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)具備：簡(jiǎn)便、低廉、合理、明確、靈敏以及重現(xiàn)性好的生物活性測(cè)定的實(shí)驗(yàn)方法[9]。

1 材料和方法

1.1 材料

試藥與動(dòng)物1 號(hào)樣品：規(guī)格2 mL:100 mg，批號(hào)20 160304；2 號(hào)樣品：規(guī)格10 mL:250 mg 批號(hào)20160302 ；A 制藥有限公司；3 號(hào)樣品：規(guī)格5 mL:250 mg 批號(hào)ZKC1501；4 號(hào)樣品：規(guī)格10 mL:400 mg 批號(hào)ZLE1501；B 制藥有限公司5 號(hào)樣品：規(guī)格5 mL:250 mg，批號(hào)15GK202-23；6 號(hào)樣品：規(guī)格5 mL:250 mg，批號(hào)15GK201-12；C 制藥有限公司。以上樣品三七總皂苷含量測(cè)定均為標(biāo)示量的80%～120%。血塞通注射液最大人用劑量6.67 mg/kg。

膠原蛋白型，酷爾生物，批號(hào)：B264565，規(guī)格1 g；鹽酸腎上腺素注射液，上海和豐制藥有限公司，批號(hào)10151101，規(guī)格1 mL:1 mg；注射用鹽酸川芎嗪，合肥平光制藥有限公司，批號(hào)201509073，規(guī)格80 mg；尼莫地平注射液，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)16051541，規(guī)格20 mL:4 mg。

試驗(yàn)動(dòng)物：小鼠，昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，ICR，SPF 級(jí)別，雌雄兼有，體重18～20 g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滇） K2015-0002。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠體內(nèi)血栓實(shí)驗(yàn) 取18～20g 小鼠96 只（雌雄各半），按體重隨機(jī)分為：陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組以及6 個(gè)批號(hào)的血塞通注射液組，共8組，每組12 只。給藥途徑為腹腔注射，給藥體積0.2 mL/10 g，連續(xù)5d 給藥，陰性對(duì)照組注射氯化鈉注射液，陽性對(duì)照組注射60 mg/kg 的注射用鹽酸川芎嗪（臨床劑量30 倍），血塞通注射液組按體重200 mg/kg 的劑量（臨床劑量30 倍） 給藥。在第5d 給藥后30 min 進(jìn)行尾靜脈注射含腎上腺素0.02 mg/mL 與膠原蛋白0.60 mg/mL 的混合誘導(dǎo)劑造成小鼠血栓模型，給藥體積0.1 mL/10 g，注射后立即觀察小鼠死亡個(gè)數(shù)以及15 min 內(nèi)小鼠偏癱未恢復(fù)數(shù)，偏癱率=（死亡個(gè)數(shù)+15 min 偏癱未恢復(fù)個(gè)數(shù)）/總個(gè)數(shù)，保護(hù)率=（未偏癱個(gè)數(shù)+15 min內(nèi)偏癱恢復(fù)個(gè)數(shù)）/總個(gè)數(shù)，陰性對(duì)照組的偏癱率大于等于80%說明造模成功。

1.2.2 小鼠斷頭存活時(shí)間實(shí)驗(yàn) 取小鼠96 只（18～20 g、雌雄各半），按體重隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組以及6 個(gè)批號(hào)的血塞通注射液組，共8 組，每組12 只，給藥途徑為腹腔注射，給藥體積均為0.2 mL/10 g。陰性對(duì)照組給予氯化鈉注射液，血塞通注射液組按200 mg/kg 的劑量（臨床劑量30 倍） 給藥，連續(xù)5 d。陽性對(duì)照組給予1.65 mg/kg 的尼莫地平注射液（臨床劑量25 倍），僅第5 天給藥。于第5 天給藥30 min 后，用大剪刀在小鼠耳下部位快速斷頭，記錄小鼠斷頭后張口喘息停止時(shí)間。

1.2.3 小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn) 取18～20g 小鼠96只（雌雄各半），按體重隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組以及6 個(gè)批號(hào)的血塞通注射液組，共8組，每組12 只，給藥途徑為腹腔注射，給藥體積均為0.2 mL/10 g。陰性對(duì)照組給予氯化鈉注射液，血塞通注射液組按200 mg/kg 的劑量（臨床劑量30倍） 給藥，連續(xù)5 d。陽性對(duì)照組給予1.65 mg/kg的尼莫地平注射液（臨床劑量25 倍），僅第5 d 給藥。第5 d 給藥30 min 后，將小鼠放入盛有15 g鈉石灰的廣口瓶?jī)?nèi)（每瓶放1 只小鼠），用凡士林涂抹瓶口并蓋嚴(yán)，使之不漏氣，開始計(jì)時(shí)，以呼吸停止為指標(biāo)，觀察小鼠因缺氧而死亡的時(shí)間。

1.2.4 小鼠游泳時(shí)間實(shí)驗(yàn)（抗疲勞實(shí)驗(yàn)） 取小鼠96 只（雌雄各半，標(biāo)準(zhǔn)體重），按體重隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組以及6 個(gè)批號(hào)的血塞通注射液組，共8 組，每組12 只，給藥途徑為腹腔注射，給藥體積均為0.2 mL/10 g。陰性對(duì)照組給予氯化鈉注射液，血塞通注射液組按200 mg/kg 的劑量（臨床劑量30 倍） 給藥，連續(xù)5d。陽性對(duì)照組給予1.65 mg/kg 的尼莫地平注射液（臨床劑量25倍），僅第5 d 給藥。在塑料大桶內(nèi)加水，水深30 cm，水溫保持在（27±0.5） ℃，各組動(dòng)物均于第5 天給藥30 min 后，在尾部束一負(fù)重物（負(fù)重物為8%體重），將小鼠分別放入塑料桶內(nèi)游泳，開始計(jì)時(shí)，注意觀察，當(dāng)小鼠頭部沉入水中10秒不能浮出水面者即為體力耗竭，即刻計(jì)時(shí)為小鼠游泳時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 軟件做統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。小鼠體內(nèi)血栓實(shí)驗(yàn)以動(dòng)物是否死亡計(jì)數(shù)，采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。小鼠：斷頭存活時(shí)間實(shí)驗(yàn)、常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)、游泳時(shí)間實(shí)驗(yàn)（抗疲勞實(shí)驗(yàn)） 的結(jié)果均采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，組間t檢驗(yàn)，

2 結(jié)果

2.1 小鼠體內(nèi)血栓實(shí)驗(yàn)結(jié)果

陽性對(duì)照組注射用鹽酸川芎嗪及4 個(gè)批號(hào)的血塞通注射液與陰性對(duì)照組比較，未偏癱個(gè)數(shù)與15min 內(nèi)偏癱恢復(fù)的數(shù)量增加，并且統(tǒng)計(jì)學(xué)具有顯著性差異，表明所檢測(cè)藥品對(duì)混合誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的急性血栓有顯著的保護(hù)作用。2 個(gè)批號(hào)的血塞通注射液與陰性對(duì)照組進(jìn)行比較小鼠的未偏癱個(gè)數(shù)和偏癱后恢復(fù)個(gè)數(shù)增多，但統(tǒng)計(jì)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 血塞通注射液對(duì)小鼠體內(nèi)血栓的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較［（），n=12］Tab.1 The effects of Xuesaitong injection on mouse thrombosis ［（），n=12］

表1 血塞通注射液對(duì)小鼠體內(nèi)血栓的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較［（），n=12］Tab.1 The effects of Xuesaitong injection on mouse thrombosis ［（），n=12］

與陰性組比較，#P＜0.05。

2.2 小鼠斷頭存活時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果

陽性對(duì)照組尼莫地平注射液及5 個(gè)批號(hào)血塞通注射液與陰性對(duì)照組比較喘息的時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中1 個(gè)批號(hào)的血塞通注射液與與陰性對(duì)照組比較喘息的時(shí)間明顯延長(zhǎng)，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 血塞通注射液小鼠斷頭存活時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較［（），n=12］Tab.2 The effects of Xuesaitong injection on mouse decapitation survival experiment ［（），n=12］

表2 血塞通注射液小鼠斷頭存活時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較［（），n=12］Tab.2 The effects of Xuesaitong injection on mouse decapitation survival experiment ［（），n=12］

與陰性組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.3 小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)結(jié)果

陽性對(duì)照組尼莫地平注射液與陰性對(duì)照組比較喘息的時(shí)間有明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；4 個(gè)批號(hào)的血塞通注射液與與陰性對(duì)照組比較喘息的時(shí)間有明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2 個(gè)批號(hào)的血塞通注射液與與陰性對(duì)照組比較喘息時(shí)間延長(zhǎng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 血塞通注射液常壓耐缺氧作用的藥效學(xué)研究［（），n=12］Tab.3 The effects of Xuesaitong injection on atmospheric anoxia experiment ［（），n=12］

表3 血塞通注射液常壓耐缺氧作用的藥效學(xué)研究［（），n=12］Tab.3 The effects of Xuesaitong injection on atmospheric anoxia experiment ［（），n=12］

與陰性組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.4 小鼠游泳時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果

陽性對(duì)照組尼莫地平注射液與陰性對(duì)照組進(jìn)行比較游泳的時(shí)間有所延長(zhǎng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；3 個(gè)批號(hào)血塞通注射液與與陰性對(duì)照組比較游泳時(shí)間的明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；3 個(gè)批號(hào)的血塞通注射液與與陰性對(duì)照組比較游泳的有時(shí)間延長(zhǎng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 血塞通注射液小鼠游泳時(shí)間實(shí)驗(yàn)（抗疲勞實(shí)驗(yàn)） 的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較［（），n=12］Tab.4 The effects of Xuesaitong injection on swimming time［（），n=12］

表4 血塞通注射液小鼠游泳時(shí)間實(shí)驗(yàn)（抗疲勞實(shí)驗(yàn)） 的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較［（），n=12］Tab.4 The effects of Xuesaitong injection on swimming time［（），n=12］

與陰性組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

3 討論

3.1 在中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加生物活性測(cè)定項(xiàng)的必要性

本研究表明，雖然6 批血塞通注射液中三七總皂苷含量均符合目前質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，但生物活性測(cè)定結(jié)果有所不同，由于不同企業(yè)的生產(chǎn)工藝或同一企業(yè)不同的原料（產(chǎn)地） 等因素的存在，導(dǎo)致血塞通注射液有效性存在明顯的不同，目前，中藥注射液存在活性成分不明，工藝可變因素多等許多問題，脫離了生物活性的成分的理化分析并不能全面地控制其質(zhì)量和充分反映其臨床療效，結(jié)合“生物活性測(cè)定”方法進(jìn)行藥品的綜合評(píng)價(jià)才能更好地反映其質(zhì)量和療效[10]。

3.2 分析結(jié)果和比較方法

本試驗(yàn)嚴(yán)格按照《中國(guó)藥典》2015 年版四部附錄“中藥生物活性測(cè)定指導(dǎo)原則”[9]進(jìn)行設(shè)計(jì)，建立的生物活性測(cè)定方法符合隨機(jī)、對(duì)照、重復(fù)藥理學(xué)研究的基本原則，選擇的檢測(cè)指標(biāo)應(yīng)客觀、專屬性強(qiáng)，與該品種的功能主治密切相關(guān)[11]。研究中，筆者選用了工藝穩(wěn)定、質(zhì)量合格且市場(chǎng)占有率較高的3 家企業(yè)生產(chǎn)的血塞通注射液共4 個(gè)規(guī)格6 個(gè)批號(hào)的樣品，根據(jù)其主要藥效學(xué)為活血化瘀抗缺氧耐疲勞，我們將生物活性測(cè)定方法集中在四個(gè)方法，即小鼠體內(nèi)血栓實(shí)驗(yàn)、小鼠斷頭存活時(shí)間實(shí)驗(yàn)、小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)、小鼠游泳時(shí)間實(shí)驗(yàn)（抗疲勞實(shí)驗(yàn)） 反復(fù)篩選。

在四個(gè)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)各實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法影響因素進(jìn)行考察，其中小鼠斷頭存活的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床有較大差異，而且，不同廠家的產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果比較接近，敏感性較差，特別是在質(zhì)量?jī)H有微小差異的情況下更不適用。小鼠游泳時(shí)間實(shí)驗(yàn)（抗疲勞實(shí)驗(yàn)） 方法簡(jiǎn)單易行，但是實(shí)驗(yàn)中小鼠游泳時(shí)水溫對(duì)小鼠是非疲勞性刺激，水溫不能保持恒定或者溫度過高過低均會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，另外動(dòng)物本身個(gè)體差異也會(huì)導(dǎo)致游泳時(shí)間差別較大，本實(shí)驗(yàn)誤差較大。小鼠體內(nèi)血栓實(shí)驗(yàn)及小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)受人為因素干擾較小且較敏感，實(shí)驗(yàn)周期短，指標(biāo)明確，操作方法簡(jiǎn)單易行，平行性好，不需要復(fù)雜儀器。小鼠體內(nèi)血栓實(shí)驗(yàn)以死亡與否為計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)方法簡(jiǎn)單成熟，小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)采用組間t檢驗(yàn)，方法簡(jiǎn)單，誤差控制限值較低。另外“生物活性測(cè)定”如果要正式收載于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，還必須考慮一些實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)選擇：背景資料清楚、影響因素少、成本低廉和檢測(cè)指標(biāo)靈敏度高的試驗(yàn)系統(tǒng)；應(yīng)盡可能選擇小鼠和大鼠等來源廣成本低的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并且符合“3R”減少和替代的原則[10]。以本實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及評(píng)價(jià)指標(biāo)為基礎(chǔ)，初步建立適宜于血塞通注射液生物活性的測(cè)定方法：小鼠體內(nèi)血栓形成實(shí)驗(yàn)和小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)。

3.3 建立生物活性檢定方法

血塞通注射液在臨床廣泛用于冠心病心絞痛腦梗死等急重癥病患，屬于急重癥用藥，應(yīng)該能保證每個(gè)批次的產(chǎn)品具有可靠的生物活性，因此，應(yīng)當(dāng)在血塞通注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加“生物活性測(cè)定”更好地綜合評(píng)價(jià)其質(zhì)量。嚴(yán)格按照《中國(guó)藥典》指導(dǎo)原則，生物活性測(cè)定建議采用：初試和復(fù)試結(jié)合評(píng)價(jià)測(cè)定結(jié)果。初步擬定標(biāo)準(zhǔn)為：實(shí)驗(yàn)一取小鼠96 只，體重18～20 g，每次實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和血塞通注射液組，每組10 只，給藥途徑為腹腔注射，給藥體積0.2 mL/10 g，連續(xù)注射5 d，陰性對(duì)照組注射氯化鈉注射液，陽性對(duì)照組注射60 mg/kg 的注射用鹽酸川芎嗪（臨床劑量30 倍），血塞通注射液組按200 mg/kg 的劑量（臨床劑量30 倍） 給藥。在第5 天給藥30 min 后進(jìn)行小鼠尾靜脈注射含腎上腺素0.02 mg/mL 與膠原蛋白0.60 mg/mL 的混合誘導(dǎo)劑造成小鼠血栓模型，給藥體積0.1 mL/10 g，注射后立即觀察小鼠死亡個(gè)數(shù)以及15 min 內(nèi)小鼠偏癱未恢復(fù)數(shù)量，偏癱率=（死亡個(gè)數(shù)+15 min 偏癱未恢復(fù)個(gè)數(shù)）/總個(gè)數(shù)，保護(hù)率=（未偏癱個(gè)數(shù)+15 min內(nèi)偏癱恢復(fù)個(gè)數(shù)）/總個(gè)數(shù)，陰性對(duì)照組的偏癱率大于等于80%說明模型成功。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)組間t檢驗(yàn)處理。結(jié)果判斷：陽性對(duì)照組鹽酸川芎嗪作用與陰性對(duì)照組進(jìn)行比較，小鼠未偏癱數(shù)與小鼠偏癱恢復(fù)個(gè)數(shù)增多，并且統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果有顯著性差異時(shí)，實(shí)驗(yàn)成立。給藥組與陰性對(duì)照組比較，小鼠未偏癱個(gè)數(shù)與小鼠偏癱恢復(fù)數(shù)增多，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果有顯著性差異時(shí)應(yīng)判為符合規(guī)定。如給藥組與陰性對(duì)照組比較，統(tǒng)計(jì)結(jié)果沒有顯著性差異，應(yīng)復(fù)試。復(fù)試時(shí)每組小鼠為15 只，其余條件同上，復(fù)試的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果具有顯著性差異，判定應(yīng)為符合規(guī)定，否則為不符合規(guī)定。

實(shí)驗(yàn)二取體重18～20 g 小鼠96 只，每次實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分成陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組血塞通組，每組10 只，給藥途徑為腹腔注射，給藥體積均為0.2 mL/10 g。陰性對(duì)照組給予氯化鈉注射液，血塞通注射液組按200 mg/kg 的劑量（臨床劑量30 倍）給藥，連續(xù)5 d。陽性對(duì)照組給予1.65 mg/kg 的尼莫地平注射液（臨床劑量25 倍），僅第5 d 給藥。第5 天給藥30 min 后，將小鼠放入盛有15 g 鈉石灰的廣口瓶?jī)?nèi)（每瓶放1 只小鼠），用凡士林涂抹瓶口蓋嚴(yán)，使之不漏氣，開始計(jì)時(shí)，以呼吸停止為指標(biāo)，觀察小鼠因缺氧而死亡的時(shí)間。結(jié)果判斷：陽性對(duì)照組作用與陰性對(duì)照組比較，小鼠喘息時(shí)間明顯延長(zhǎng)，用組間t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，當(dāng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果有顯著性差異時(shí)，實(shí)驗(yàn)成立。給藥組與陰性對(duì)照組進(jìn)行比較，小鼠喘息的時(shí)間應(yīng)明顯延長(zhǎng)，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)具有顯著性差異時(shí)判為符合規(guī)定。如給藥組與陰性對(duì)照組比較，統(tǒng)計(jì)結(jié)果沒有顯著性差異，應(yīng)復(fù)試。復(fù)試時(shí)每組小鼠數(shù)量為15 只，其余條件同上，復(fù)試的結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，判定為符合規(guī)定，否則為不符合規(guī)定。