向盈盈 ，于鴻濱，周 靜，楊向紅，宋 飛，魏云林，季秀玲

（1） 昆明市延安醫(yī)院口腔科，云南昆明 650031；2） 昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院微創(chuàng)介入科，云南昆明 650106；3） 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650500）

在臨床中，糞腸球菌（Enterococcus faecalis）是院內(nèi)感染的常見和主要條件致病菌，可引起泌尿道[1]、生殖道、腹腔、盆腔、手術(shù)傷口、血液感染及口腔感染[2]。

口腔感染性疾病中的難治性根尖周炎（Refractory periapical periodontitis） 又稱頑固性根尖周炎，是指經(jīng)反復(fù)多次規(guī)范根管治療仍遷延不愈的疾病，它是口腔醫(yī)師面臨的棘手問題，也是牙髓病臨床治療的難題。該病可以造成患者復(fù)發(fā)性根尖周膿腫和進(jìn)行性骨質(zhì)破壞，并導(dǎo)致牙齒喪失和牙槽骨缺損，嚴(yán)重影響患者的治療效果和生存質(zhì)量。研究證實(shí)糞腸球菌（E.faecalis） 是根管治療后再感染和難治性根尖周炎的主要病原菌[3-4]，糞腸球菌的檢出率與根尖周破壞呈正相關(guān)[5]。在根管治療后持續(xù)性感染的根尖周糞腸球菌檢出率明顯增高，最高達(dá)77%[6]，糞腸球菌甚至成為根管治療后根管再次感染的唯一檢出細(xì)菌。因此，控制糞腸球菌感染在根管治療中十分重要，徹底清除糞腸球菌是提高難治性根尖炎治愈率的關(guān)鍵。

本研究從昆明市延安醫(yī)院口腔科再治療根管中采集根管內(nèi)細(xì)菌樣本，分離樣本中的致病性糞腸球菌，對(duì)其進(jìn)行鑒定，并研究其生物學(xué)特性，為臨床治療難治性根尖周炎提供研究材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

心腦培養(yǎng)基（Brain Heart Infusion）：簡稱BHI培養(yǎng)基，OXOID，英國貝星斯托克。

1.2 樣本采集對(duì)象

自2016 年1 月至12 月就診于昆明市延安醫(yī)院口腔科門診的患者中選取需進(jìn)行根管再治療的21 名人員，其中男性9 名，女性12 名，年齡18～50 歲。所有患牙均因患牙根管治療后疼痛前來就診，需要進(jìn)行根管再治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：口內(nèi)齲齒、根尖竇道或瘺管、牙周病（牙周探診深度＞5 mm）、懷孕及本次治療前6 個(gè)月內(nèi)局部或者全身性使用過抗生素的患者。所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 抗生素抗性平板的配制 將青霉素G、克林霉素、氨芐西林加無菌蒸餾水溶解后，過濾除菌后備用。四環(huán)素加入乙醇溶解，四種抗生素貯存液的濃度均調(diào)整為10 mg/mL。將已滅菌的四瓶BHI 瓊脂培養(yǎng)基冷卻到50℃左右，分別加入上述四種抗生素（終濃度為10 μg/mL），搖勻后倒平板。

1.3.2 樣本的采集 在患者治療過程中完成再治療根管內(nèi)糞腸球菌樣本的采集工作，采集方法參照Pinheiro[7]文獻(xiàn)報(bào)道的方法并加以改進(jìn)。整個(gè)操作過程保證嚴(yán)格無菌操作。首先用橡皮障隔離患牙，去除患牙冠部的充填體、去盡齲壞組織、暴露根管口，用3%過氧化氫液和25 g/L 次氯酸鈉液交替清潔牙面，然后用GG 鉆和不銹鋼K 銼去除原根充物（注意：這一過程不使用任何化學(xué)溶劑）。再用根管測(cè)量儀測(cè)定根管工作長度，接著用生理鹽水沖洗根管去除殘留的根充物并使根管保持濕潤狀態(tài)，最后將干燥無菌紙尖插入根管并達(dá)到工作長度，停留60 s 后將紙尖轉(zhuǎn)至BHI 液體培養(yǎng)基內(nèi)。

1.3.3 致病菌的分離及培養(yǎng) 37℃，150 r/min，有氧條件下孵育24 h 后觀察。如果培養(yǎng)基變渾濁，證明培養(yǎng)基中有細(xì)菌生長；如果培養(yǎng)基清亮或者顏色無變化則認(rèn)為培養(yǎng)基中無細(xì)菌生長，陰性結(jié)果。

取培養(yǎng)基變渾濁的陽性結(jié)果樣本，用接種環(huán)蘸取少量液體在四種抗生素抗性固體培養(yǎng)基上劃線，37℃，150 r/min 恒溫培養(yǎng)24 h。然后將初步認(rèn)為是類腸球菌的菌株利用16S rRNA 基因序列分析法鑒定細(xì)菌。

1.3.4 致病菌的革蘭氏染色 培養(yǎng)菌液至對(duì)數(shù)生長期（OD600=1） 時(shí)，用接菌環(huán)蘸取菌懸液均勻涂抹于干凈的載玻片上，采用經(jīng)典革蘭氏染色法進(jìn)行染色后鏡檢。于油鏡下觀察致病菌的菌體形態(tài)特征，確定革蘭氏染色結(jié)果。

1.3.5 致病菌的透射電鏡觀察 取新分離菌的培養(yǎng)液（OD600=1） 25 μL 加入50 μL 濃度為0.5%的戊二醛，取混合液滴在一枚有碳膜的銅網(wǎng)中間，靜止30 min，用吸水紙吸取多余液體，小心不要弄破銅網(wǎng)，取2%磷鎢酸滴在銅網(wǎng)上，室溫下對(duì)混合液進(jìn)行染色2 min，后用吸水紙吸取多余染液，室溫下待銅網(wǎng)晾干，然后進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.3.6 16S rRNA 基因序列分析 利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取所有口腔臨床分離菌株的基因組DNA，嚴(yán)格遵從產(chǎn)品說明書的方法和步驟。

利用細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物（27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-G GTTACCTTGTTACGACTT-3'） 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為50 μL：2 μL 因組模板、引物各1 μL，2.5 mM dNTP 4 μL、Ex-TaqDNA 聚合酶0.5 μL，10×Ex-Taqbuffer 5 μL，加滅菌蒸餾水補(bǔ)足至50 μL。PCR 反應(yīng)程序如下：98℃變性30 s，50℃退火45 s，72℃延長90 s，以上過程循環(huán)30次。PCR 產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。PCR 產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接，并轉(zhuǎn)化糞腸球菌DH5，陽性克隆進(jìn)行序列測(cè)定，最后將測(cè)序的16S rRNA 基因序列提交NCBI 數(shù)據(jù)庫，并與數(shù)據(jù)庫中的其他相關(guān)基因組序列進(jìn)行比對(duì)，建立同源系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化，初步確定分離物的分類地位。

1.3.7 同源系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化的構(gòu)建 把測(cè)序獲得的序列在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)分析，挑選相似度高的序列，利用Mega 5.1 進(jìn)行分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用Neighbor-joining 方法，即N-J 法進(jìn)行分析。

1.3.8E.faecalisYN771 的生物學(xué)特性研究（1）E.faecalisYN771 的生長溫度范圍：將保存在4℃糞腸球菌菌懸液作為菌種，接種到新鮮BHI 固體平板上，分別倒置于4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、37℃、42℃和55℃不同溫度的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，觀察記錄糞腸球菌生長狀況，實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3 次。（2）E.faecalisYN771 的生長曲線：紫外分光光度儀測(cè)定生長曲線中零時(shí)讀數(shù)的OD600吸光度值，之后從60 min 開始取樣，一直觀察到310 min。每次取2 mL 測(cè)定OD600值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，各時(shí)間OD600數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制糞腸球菌的一步生長曲線。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3 次。（3）E.faecalisYN771 的代時(shí)測(cè)定。代時(shí)是指分裂一代所用的是時(shí)間，單位為分鐘。在最適條件（營養(yǎng)、pH 和溫度） 下，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，在不同時(shí)間后計(jì)數(shù)單位體積中的細(xì)菌個(gè)數(shù)，計(jì)算細(xì)菌數(shù)目增大一倍所需要的平均時(shí)間。E.faecalisYN771 培養(yǎng)2 h 取出100 μL 菌懸液，梯度稀釋后做活菌計(jì)數(shù)，3.8 h 時(shí)取出100 μL 菌懸液，梯度稀釋后再次做活菌計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3 次；（4）E.faecalisYN771 的耐藥性：取對(duì)數(shù)期E.faecalis YN771 5mL送至昆明市延安醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，包含12 種抗生素，分別為：青霉素G、氨芐西林、環(huán)丙沙星、紅霉素、左氧氟沙星、替加環(huán)素、利奈唑胺、莫西沙星、萬古霉素、奎奴普丁、克林霉素、四環(huán)素。

2 結(jié)果

2.1 致病菌的鑒定結(jié)果

2.1.1 致病菌的形態(tài)觀察 經(jīng)抗生素抗性平板培養(yǎng)，在青霉素G、氨芐西林和四環(huán)素平皿上均無細(xì)菌生長，僅在克林霉素抗性培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)6 個(gè)菌落，各菌落的形態(tài)均一致，每個(gè)菌落直徑約0.5～1.0 mm，呈圓形，菌落不透明，灰白色、表面光滑。將6 個(gè)菌落分別經(jīng)三次劃線純化后轉(zhuǎn)接至新的抗性平皿上均能生長，隨機(jī)挑取其中的一個(gè)單菌落接種至液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待菌液處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，取100 μL 梯度稀釋后涂板，37℃恒溫孵育24 h 后，菌落形態(tài)見圖1A。光學(xué)顯微鏡下經(jīng)革蘭氏染色的菌體形態(tài)如圖1B 所示，圓形或橢圓形，呈鏈狀排列，為G+菌。透射電鏡觀察到細(xì)菌無芽胞，無鞭毛，直徑0.9～1.1 μm（圖1C、D）。

圖1 細(xì)菌的形態(tài)Fig.1 Morphology of bacteria

2.1.2 16S rRNA 基因序列分析 PCR 成功擴(kuò)增出大小約1，500 bp 的目的片段。16S rRNA 基因測(cè)序獲得長為1，466 bp 的有效片段。

2.1.3 構(gòu)建致病菌的同源系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹 同源序列比對(duì)表明：YN771 菌株與糞腸球菌的同源性最高，達(dá)到99%，將其命名為糞腸球菌YN771（Enterococcus faecalis YN771），序列提交NCBI 數(shù)據(jù)庫，GenBank 登錄號(hào)為MH919370。

以芽孢桿菌16S rRNA 基因作為外群，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹見圖2，可以看出，YN771 菌株與糞腸球菌的相似度最高。

圖2 E.faecalis YN771 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系Fig.2 Phylogenetic analysis of E.faecalis YN771

2.2 E.faecalis YN771 生物學(xué)特性

E.faecalisYN771 生長溫度范圍E.faecalisYN771 生長溫度范圍結(jié)果見表1，生長溫度范圍在20～42℃，最適溫度約為37℃。

表1 E.faecalis YN771 在不同溫度下的生長情況Tab.1 Growth of E.faecalis YN771 at different temperatures

2.3 E.faecalis YN771 生長曲線

通過吸光度法測(cè)定E.faecalisYN771 的生長情況，并根據(jù)吸光度繪制了該菌的生長曲線，如圖3所示。E.faecalisYN771 的吸光度值隨著時(shí)間的延長而不斷上升。宿主菌按1%的接種量，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)160 min 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，對(duì)數(shù)生長期維持時(shí)間較短，大約有80 min，培養(yǎng)240 min 進(jìn)入到平臺(tái)期。

圖3 E.faecalis YN771 的生長曲線Fig.3 The growth curves of E.faecalis YN771

2.4 E.faecalis YN771 的代時(shí)

在最適生長條件：BHI 培養(yǎng)基，37℃，pH 7條件下培養(yǎng)，E.faecalisYN771 培養(yǎng)1 h 時(shí)的活菌計(jì)數(shù)為9×107cfu/mL，培養(yǎng)至2.8 h 的活菌計(jì)數(shù)為6×109cfu/mL。

將數(shù)值代入公式G=1/R=（t2-t1）/3.322（lgx2-lgx1） 計(jì)算，G=18 min，代時(shí)確定為18 min。

2.5 E.faecalis YN771 的耐藥性

E.faecalisYN771 耐藥性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，可以看出，E.faecalis YN771 對(duì)青霉素G、氨芐西林、環(huán)丙沙星、紅霉素、左氧氟沙星、替加環(huán)素、利奈唑胺、莫西沙星、萬古霉素、四環(huán)素表現(xiàn)出敏感性，對(duì)奎奴普丁藥敏性不高，但對(duì)克林霉素表現(xiàn)耐藥性。

表2 E.faecalis YN771 耐藥性檢測(cè)Tab.2 Antibiotics-resistance of E.faecalis YN771

3 討論

糞腸球菌是根管治療后根尖周炎的主要檢出菌[8]，本實(shí)驗(yàn)從臨床再治療根管中分離得到一株糞腸球菌。在平皿上觀察該菌的菌落直徑約0.5～1.0 mm，菌落不透明，灰白色、表面光滑。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌為G+菌，圓形或橢圓形，呈鏈狀排列，透射電鏡觀察到細(xì)菌無芽胞，無鞭毛，直徑0.9～1.1 μm，完全符合糞腸球菌的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，但是鏈球菌在瓊脂培養(yǎng)基也可以形成圓形、表面光滑、針尖大小的菌落，這些特征與糞腸球菌很相似[9]，單憑觀察其染色特性和形態(tài)特性難于把兩者完全區(qū)分。為了進(jìn)一步鑒別細(xì)菌種屬，我們通過16S rRNA 基因序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示再治療根管分離株與收錄的糞腸球菌序列同源性最高，綜合以上幾個(gè)方面的鑒定，確定該分離菌株為糞腸球菌，并將其命名為糞腸球菌YN771。

本實(shí)驗(yàn)得出E.faecalisYN771 生長溫度范圍在20～42℃，最適溫度約為37℃，這一結(jié)果與Erika等人所報(bào)道的研究結(jié)果一致[10]，Erika 認(rèn)為糞腸球菌在BHI 培養(yǎng)基上生長溫度為6.5～47.8℃。37℃與人體及動(dòng)物的口腔內(nèi)的溫度相適應(yīng)，為后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的開展提供了數(shù)據(jù)支持，研究結(jié)果也表明E.faecalis YN771 可以在動(dòng)物口腔內(nèi)正常生長。溫度是細(xì)菌生長的最重要影響因素，對(duì)數(shù)期的熱耐受性最弱，從穩(wěn)定期開始到饑餓期，細(xì)菌表現(xiàn)出越來越強(qiáng)的熱耐受性[11-12]。糞腸球菌熱耐受性主要與兩個(gè)重要的因素有關(guān)，一是與細(xì)胞膜中脂質(zhì)與脂肪酸的含量有關(guān)，越靠近細(xì)菌生長的最低溫度，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定[12]。隨著外界溫度的升高，膜內(nèi)飽和脂肪酸含量逐漸增加，而不飽和脂肪酸含量下降，則糞腸球菌活力減弱[13]。二是與細(xì)菌的生長階段有關(guān)，到饑餓期，周圍環(huán)境營養(yǎng)匱乏或低溫光照的環(huán)境下達(dá)到較低的代謝水平，即進(jìn)入糞腸球菌饑餓狀態(tài)或活的非可培養(yǎng)（viable but nonculturable，VBNC） 狀態(tài)，但仍保持良好的外膜完整性、黏附能力、侵入力、基因合成和表達(dá)能力，同時(shí)其外膜發(fā)生特異性變化。當(dāng)外界環(huán)境適宜后，其繁殖能力可迅速恢復(fù)[14-15]。

E.faecalisYN771 對(duì)青霉素G 等10 中抗生素敏感，而對(duì)克林霉素具有耐藥性。由于實(shí)驗(yàn)中使用的抗生素種類少，不排除其仍會(huì)對(duì)其他抗生素耐藥。該菌之所以能夠?qū)е码y治性根尖周炎的形成，除本身具有部分抗生素抗性外，一個(gè)更主要的原因是在根尖周微環(huán)境中有效形成了生物膜的結(jié)構(gòu)，這方面的研究也值得關(guān)注。微生物形成的生物膜能使細(xì)菌耐藥性提高100～1 000 倍[16]。在臨床口腔治療中，根管消毒劑氫氧化鈣液pH 只有達(dá)11.5 時(shí)，才能殺死99.99%的糞腸球菌[17]，提高次氯酸鈉、氯己定、洗必泰及鉀絡(luò)合物（iodinepotassiumiodide，IKI） 的濃度也無法完全清除糞腸球菌[18-20]，仍能在預(yù)備后的根管內(nèi)存活。糞腸球菌可以單獨(dú)形成生物膜，提高了細(xì)菌之間的能量交換、信號(hào)傳遞以及對(duì)惡劣環(huán)境的抵抗力量。糞腸球菌主要利用口腔食物中的碳水化合物、氨基酸、甘油、乳酸和許多酮酸等[21]產(chǎn)生能量。當(dāng)營養(yǎng)匱乏、周圍環(huán)境惡劣時(shí)，生物膜中的糞腸球菌的侵襲性增加，不斷改變膜蛋白的表達(dá)，特別是表面毒力蛋白明膠酶E（Gelatinase E，GelE）、Ebp （Endocarditis and Biofilm Associated pili） R 和分選酶（Sortase，Srt）等在糞腸球菌生物膜形成過程中表達(dá)明顯增加[22-26]。細(xì)菌會(huì)自發(fā)躲避惡劣的環(huán)境，通過絲氨酸蛋白酶，明膠酶，結(jié)合膠原蛋白粘附到牙本質(zhì)小管深層、分叉區(qū)、三角區(qū)、不規(guī)則區(qū)等[27]。研究證實(shí)其侵襲能力與細(xì)菌中含有的被稱為“毒力島”的DNA 片段[28]有關(guān)。

本研究從臨床再治療根管中分離得到一株致病性糞腸球菌，通過生理生化特性及分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，為臨床治療難治性根尖周炎提供研究材料和研究基礎(chǔ)。