許曉燕，周 州，2，余夢瑤，江 南，歐亞龍，羅 霞

（1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院菌類藥材系統(tǒng)研究與開發(fā)實驗室中藥材品質(zhì)及創(chuàng)新中藥研究四川省重點實驗室，四川 成都 610041；2.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 611700）

銀耳（Tremella fuciformis） 屬擔(dān)子菌門（Basidiomycete） 銀耳綱 （Tremella） 銀耳目 （Tremella） 銀耳科（Tremella）、銀耳屬（Tremella），是一種藥用價值極高的食（藥）用真菌，性平，味甘淡，無毒，既是天然功能食品，又是食品加工中的天然添加劑[1]。銀耳多糖是銀耳中重要的生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、預(yù)防腸道疾病等功效[2]。近年來以銀耳為原料的食品研究不斷推陳出新，開發(fā)了如銀耳保健醋、銀耳姜汁乳飲料、銀耳餅干等產(chǎn)品[3-5]。

槐花為豆科植物槐樹（Sophora japonica） 的干燥花，性微寒，味苦，具有涼血止血、清肝瀉火的功效[6]。蘆丁作為槐花的標(biāo)志性成分，在調(diào)節(jié)毛細(xì)血管通透性和脆性、降壓及改善微循環(huán)等方面效果顯著[7-8]，以蘆丁、多酚、多糖、精油等為指標(biāo)對槐花的提取工藝及抗氧化、抑菌、降血糖等作用的研究充分[9-14]?；被ㄔ谑称烽_發(fā)方面也已受到關(guān)注，如槐花麥飯[15]、槐花綠茶[16]等。

基于改善女性產(chǎn)后子宮收縮不良，惡露不絕癥狀的臨床驗方，以組方中主要原料槐花和銀耳為研究對象，通過該固體飲料制備工藝過程和穩(wěn)定性試驗結(jié)果，提供一種銀耳槐花的最佳提取工藝、濃縮方式，保證其顆粒性質(zhì)及穩(wěn)定性。

1 試驗部分

1.1 材料與試劑

槐花、銀耳，四川千方中藥飲片有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，成都普思生物科技股份有限公司，批號PS01207；D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，成都普思生物科技股份有限公司，批號PS010303。

1.2 儀器與設(shè)備

CS4000HPLC高效液相色譜，成都奧泰萬普科技有限公司；UV-2860s紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公；DZF-6020真空干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；RE-52AA/52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；JOYA-8000T噴霧干燥機，上海喬楓實業(yè)有限公司；KXH-101-2A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上?？莆鲈囼瀮x器廠；AL104電子分析天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易 (上海)有限公司；YP1201N電子稱，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHH-250SD藥品穩(wěn)定性實驗箱，上海建恒儀器有限公司。

2 方法

2.1 蘆丁檢測方法

參考《中國藥典》第一部2015版槐花蘆丁含量檢測法測定[6]。

2.2 多糖測定方法

參考《中國藥典》第一部2015版硫酸蒽酮法測定[6]。

2.3 干膏得率檢測方法

精密量取提取液100 mL，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后于105℃干燥至恒重，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，干膏得率（DE，%）計算公式為：

式中：W1為已干燥至恒重的蒸發(fā)皿重量（g）；W2為干燥后膏體與蒸發(fā)皿總重（g）；W3為藥材重量（g）。

2.4 單因素試驗

2.4.1 浸泡時間

精密稱取槐花50 g，加60%乙醇500 mL。分別浸泡0、30 min、60 min、90 min后回流提取60 min，共2次。過濾，合并濾液，濃縮，定容至1 000 mL。測定干膏得率和蘆丁質(zhì)量。

精密稱取銀耳50 g，加入水500 mL。分別浸泡0、30 min、60 min、90 min后回流提取60 min，共2次；過濾，合并濾液，濃縮，定容至1 000 mL。測定干膏得率和粗多糖得率。

2.4.2 料液比

精密稱取槐花50 g，分別按6倍、10倍、15倍、20倍的料液比加入60%乙醇，回流提取60 min，共2次。過濾，合并濾液，濃縮，定容至1 000 mL。測定干膏得率和蘆丁質(zhì)量。

精密稱取銀耳50 g，分別按6倍、10倍、15倍、20倍的料液比加入水，回流提取60 min，共2次。過濾，合并濾液，濃縮，定容至1 000 mL。測定干膏得率和粗多糖得率。

2.4.3 提取時間

精密稱取槐花50 g，加入60%乙醇500 mL回流提取2次，分別每次提取30 min、60 min、90 min、120 min。過濾，合并濾液，濃縮，定容至1 000 mL。測定干膏得率和蘆丁質(zhì)量。

精密稱取銀耳50 g，加入水500 mL。回流提取3次，分別提取30 min、60 min、90 min、120 min。過濾，合并濾液，濃縮，定容至1 000 mL。測定干膏得率和粗多糖得率。

2.4.4 提取次數(shù)研究

精密稱取槐花50 g，加入60%乙醇500 mL。回流提取60 min，分別提取1次、2次、3次、4次。過濾，合并濾液，濃縮，定容至1 000 mL。測定干膏得率和蘆丁質(zhì)量。

精密稱取銀耳50 g，加入水500 mL。回流提取60 min，分別提取1次、2次、3次、4次。過濾，合并濾液，濃縮，定容至1 000 mL。測定干膏得率和粗多糖得率。

2.4.5 正交試驗

基于單因素試驗結(jié)果，選擇料液比、提取時間和提取次數(shù)3個因素水平各3個，按照L9（34）正交表安排試驗，詳見表1、表2。

表1 槐花提取工藝正交試驗因素水平表Tab.1 Sophora japonica extraction process

表2 銀耳提取工藝正交試驗因素水平表Tab.2 Level and factor of Tremella fuciformis extraction process

以蘆丁和干膏得率為指標(biāo)對槐花提取工藝進(jìn)行綜合評價，設(shè)定蘆丁質(zhì)量權(quán)重為70%，干膏得率權(quán)重為30%，綜合評價（Z）計算公式為：

式中：X1為蘆丁獲質(zhì)量（mg）；Y1為蘆丁干膏得率（%）；A1為正交試驗結(jié)果中蘆丁質(zhì)量最大值（mg）；B1為正交試驗結(jié)果中干膏得率最大值（%）。

以粗多糖和干膏得率為指標(biāo)對銀耳提取工藝進(jìn)行綜合評價，設(shè)定粗多糖得率權(quán)重為70%，干膏得率權(quán)重為30%，綜合評價（Z）計算公式為：

式中：X2為粗多糖獲質(zhì)量（mg）；Y2為粗多糖干膏得率（%）；A2為正交試驗結(jié)果中粗多糖質(zhì)量最大值（mg）；B2為正交試驗結(jié)果中粗多糖得率最大值（%）。

2.5 除雜工藝研究

槐花經(jīng)60%乙醇提取獲得，提取液中所含的固體微粒和大分子物質(zhì)較少，故提取液只需用尼龍濾布濾過即可。銀耳采用水提，因含有較多的雜質(zhì)，則采用高速離心法（6 000 r·min-1離心20 min） 除去水提取液中的固體微粒體系。

2.6 濃縮工藝研究

分別采用常壓濃縮和減壓濃縮方式濃縮槐花提取液和銀耳提取液，考察濃縮方式對蘆丁和粗多糖含量的影響。常壓濃縮溫度為90℃～100℃，減壓濃縮條件為 50℃～70℃、真空度 0.08 MPa[17]。

2.7 干燥工藝研究

藥材清膏采用中藥常用的噴霧干燥方法[18]，根據(jù)濃縮工藝所得提取液，噴霧干燥條件為料液密度1.08（60℃） ～1.10 （60℃），進(jìn)料溫度 50℃～60℃，進(jìn)風(fēng)溫度為185℃～195℃，出風(fēng)溫度為95℃～105℃。

2.8 制粒工藝研究

根據(jù)噴霧干燥成品特性，加入16.7%麥芽糊精和13%玉米淀粉作為填充劑，5%黃原膠作為增稠劑，加入0.2%安賽蜜改善口感。采用濕法制粒。以70%乙醇制備軟材，20目篩制粒，50℃干燥，至水分＜4%，16目篩整粒，并對顆粒臨界相對濕度和流動性進(jìn)行測定。

2.8.1 臨界相對濕度測定

分別取濕法制粒所得顆粒14份，每份約0.5 g，置于已干燥至恒重的稱量瓶中，精密稱定，將稱量瓶蓋揭開，置于7種不同相對濕度的干燥器中，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中放置72 h，取出稱量瓶，加蓋后精密稱定，計算含水量，繪制相對濕度曲線圖。

2.8.2 顆粒流動性測定

采用測定休止角的方法考察顆粒流動性。采用固定漏斗法，將3只漏斗串連并固定于水平放置的坐標(biāo)紙上，將制成的顆粒沿漏斗壁倒入最上面的漏斗中，直到坐標(biāo)紙上形成的藥粉圓錐體尖端接觸到漏斗口為止，由坐標(biāo)紙讀出圓錐底部的直徑，重復(fù)測定5次。休止角tgα（°） 計算公式為：

式中：H為漏斗口距坐標(biāo)紙的距離（cm）；R為圓錐底部半徑（cm）。

2.9 穩(wěn)定性試驗

2.9.1 加速試驗

將銀耳槐花固體飲料產(chǎn)品置于加速條件［溫度（40±2）℃，相對濕度 （75±2）%］ 下放置 6個月，于第0月、第1月、第2月、第3月、第6月取樣檢查。

2.9.2 長期試驗

將銀耳槐花固體飲料產(chǎn)品置于室溫條件下放置18個月，于第0月、第1月、第2月、第3月、第6月、第9月、第12月、第18月取樣檢查。

2.9.3 感官指標(biāo)檢測

取適量銀耳槐花固體飲料產(chǎn)品內(nèi)容物置于白色瓷盤中，在自然光下觀察色澤和狀態(tài)，嗅其氣味，品其滋味。

2.9.4 水分及重金屬測定

按GB 5009.3《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》、GB/T 5009.11《食品中總砷及無機砷的測定》、GB 5009.12《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鉛的測定》、GB/T 5009.17《食品中總汞及有機汞的測定》測定銀耳槐花固體飲料產(chǎn)品的水分和鉛、砷、汞含量。

2.9.5 微生物測定

按GB 4789.2《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》、GB 4789.3《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)》、GB 4789.4《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》、GB 4789.10《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》、GB 4789.15《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)》測定銀耳槐花固體飲料產(chǎn)品中的菌落總數(shù)、霉菌、大腸菌群、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌。

3 結(jié)果與分析

3.1 提取工藝單因素試驗及正交優(yōu)化結(jié)果

3.1.1 槐花提取溶劑選擇

不同乙醇濃度溶液提取槐花的結(jié)果見表3。

由表3可知，隨著乙醇濃度的增加，槐花中蘆丁的得率呈先增加后降低的趨勢，以60%乙醇提取的蘆丁最多，每克槐花可提取70.36 mg蘆丁。因此，槐花采用60%乙醇進(jìn)行提取。

表3 不同乙醇濃度溶液對蘆丁質(zhì)量的影響Tab.3 Effect of extraction solvent on rutin content

3.1.2 槐花提取工藝單因素試驗結(jié)果

槐花提取工藝單因素試驗結(jié)果見表4。

由表4可知，浸泡時間對于蘆丁質(zhì)量和干膏得率影響不大；料液比和提取時間與蘆丁質(zhì)量呈正相關(guān)；料液比和提取次數(shù)與干膏得率呈正相關(guān)。

表4 槐花提取工藝單因素試驗結(jié)果Tab.4 Single factor experiment results of Sophora japonica extraction process

3.1.3 槐花提取工藝正交試驗結(jié)果

槐花提取工藝正交試驗和綜合評價結(jié)果見表5。

表5 槐花提取工藝正交試驗結(jié)果Tab.5 Orthogonal test results of Sophorea japonica extraction process

由表5可知，影響提取的因素順序為C＞A＞B，極差分析發(fā)現(xiàn)C因素的影響具有顯著意義；試驗組合7號的水平最優(yōu)，驗證試驗結(jié)果見表6。

表6 驗證試驗結(jié)果Tab.6 Verification of experimental results

由表6可知，A3B1C3組合最佳，RSD分別為1.22%和 0.30%。

3.1.4 銀耳提取工藝單因素試驗結(jié)果

銀耳提取工藝單因素試驗結(jié)果見表7。

表7 銀耳提取工藝單因素試驗結(jié)果Tab.7 Single factor experiment results of Tremella fuciformis extraction process

由表7可知，浸泡時間對于粗多糖和干膏得率影響不大；隨著料液比的增加，粗多糖得率呈先增加后降低的趨勢，10倍水提有利于粗多糖的提?。惶崛r間和次數(shù)與粗多糖和干膏得率呈正相關(guān)。

3.1.5 銀耳提取工藝正交優(yōu)化結(jié)果

銀耳提取工藝正交試驗和綜合評價結(jié)果見表8。

由表8可知，影響提取的因素順序為B＞A＞C，極差分析發(fā)現(xiàn)A、B和C三種因素均不具有顯著意義；試驗組合8號的水平最優(yōu)，驗證試驗結(jié)果見表9。

由表9可知，A3B1C3組合最佳，RSD分別為0.46%和 0.68%。

表8 銀耳提取工藝正交試驗結(jié)果Tab.8 Orthogonal test results of Tremella fuciformis extraction process

表9 驗證試驗結(jié)果Tab.9 Verification test results

3.2 濃縮方式對蘆丁和粗多糖得率的影響

提取液濃縮前后成分含量見表10。

表10 提取液濃縮前后成分含量變化Tab.10 Changes in the content of ingredients before and after concentration of the extract

由表10可以看出，通過常壓濃縮獲得的浸膏中蘆丁和粗多糖含量分別為 34.52 mg·g-1和 31.18 mg·g-1，由減壓濃縮獲得的浸膏中蘆丁和粗多糖含量分別為 36.54 mg·g-1和 32.52 mg·g-1，其保有率達(dá)97.48%和94.32%。故本品宜采用減壓濃縮。

3.3 臨界相對濕度的測定結(jié)果

通過在室溫25℃下，分別測定相對濕度為30%～90%顆粒吸濕前后重量，計算吸濕率，結(jié)果見表11；繪制臨界相對濕度曲線圖，見圖1。

表11 各種相對濕度條件下顆粒吸濕結(jié)果Tab.11 Moisture absorption results of particles under various relative humidity conditions

由表11可知，隨著相對濕度的提高，顆粒吸濕率呈逐漸增大趨勢。

由圖1可知，本品顆粒的臨界相對濕度為60%。因此，要求本品生產(chǎn)車間（包括制粒車間和分裝車間，25℃）的相對濕度應(yīng)控制在60%以下。

3.4 顆粒流動性結(jié)果

樣品編號1～編號3顆粒休止角分別為35.68°、36.38°、35.82°，均值為 35.96°。本品顆粒休止角小于40°，流動性良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

恒溫恒濕加速試驗結(jié)果見表12，長期試驗結(jié)果見表13。

由表12、表13可知，由前述工藝制得的銀耳槐花固體飲料在加速試驗0、1個月、2個月、3個月、6個月和長期試驗0、1個月、2個月、3個月、6個月、9個月、12個月、18個月的感官指標(biāo)良好；水分隨著時間增加略有增加，但均符合GB 5009.3國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定（≤7.0%）；測試期內(nèi)，重金屬含量變化趨勢一致，總砷含量為 0.01 mg·kg-1，鉛含量為 0.10 mg·kg-1，總汞含量為 0.10 mg·kg-1，分別符合 GB/T 5009.11 總砷含量規(guī)定 （≤1.0 mg·kg-1)、GB5009.12鉛含量規(guī)定 （≤2.0 mg·kg-1)、GB/T 5009.17 總汞含量規(guī)定（≤0.3 mg·kg-1)；微生物限量變化趨勢一致，菌落總數(shù)含量＜10 CFU·g-1、霉菌＜10 CFU·g-1、大腸桿菌＜10 CFU·g-1、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均未檢出，分別符合GB 4789.2菌落總數(shù)限量標(biāo)準(zhǔn)（≤3×104CFU·g-1)、GB 4789.15 霉菌限量標(biāo)準(zhǔn)（≤50 CFU·g-1)、GB 4789.3 大腸菌群限量標(biāo)準(zhǔn)（≤100 CFU·g-1)、GB 4789.10 和 GB 4789.4 金黃色葡萄球菌（≤0/25 g）、沙門氏菌（≤0/25 g） 限量標(biāo)準(zhǔn)。

表12 恒溫恒濕加速試驗結(jié)果Tab.12 Constant temperature and humidity accelerated test results

表13 長期穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab.13 Long-term stability test results

4 結(jié)論

通過對銀耳槐花提取工藝正交、提取液濃縮方式、顆粒臨界相對濕度和流動性性質(zhì)，以及穩(wěn)定性試驗，獲得了一種銀耳槐花固體飲料制備方法。試驗表明，槐花通過60%乙醇提取時蘆丁得率最高，最佳提取工藝為槐花料液比（1∶20）、提取時間20 min、提取3次；銀耳最佳提取工藝條件為料液比（1∶20）、提取時間90 min、提取4次。適宜采用減壓濃縮方式對提取液進(jìn)行濃縮，使得蘆丁和粗多糖保有率分別高達(dá)97.48%和94.32%。按照本文制備方法制得的銀耳槐花固體飲料顆粒臨界相對濕度（25℃）為60%，顆粒休止角＜40°，且長期和加速穩(wěn)定性試驗結(jié)果良好，可為同類銀耳槐花等藥食同源食品開發(fā)提供工藝參考。