劉巖巖，李 紅，劉國麗，王 紅，劉俊杰，呂立濤

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，遼寧省食用菌優(yōu)質(zhì)栽培重點實驗室，遼寧 沈陽 110161）

黑木耳 （Auricularia auricula） 屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 銀耳目 （Auriculariales） 木耳科（Auriculariaceae）。黑木耳屬于一種中溫型菌類，適合在潮濕溫暖的氣候條件下生長。在自然條件下，多樹發(fā)生在雨后，在枯死的樹枝干或是樹樁上生長。其子實體常覆瓦狀疊生、叢生、形同人耳。剛生長時為柔軟的膠質(zhì)，富彈性，生長一段時間后稍帶軟骨質(zhì)，半透明狀[1]。晾曬后耳片縮小，變成黑色且硬、脆，近革質(zhì)[2]。我國可人工繁育的黑木耳優(yōu)良品種較少，大多數(shù)為野生菌種馴化得來，穩(wěn)定性和豐產(chǎn)性都較差。篩選出品質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)量高、商品性狀好、市場前景佳的優(yōu)良菌株對遼寧省黑木耳產(chǎn)業(yè)發(fā)展至關(guān)重要[3-4]。通過生物學(xué)特性和蛋白標記的方法，對遼寧省所在地區(qū)主栽的14個黑木耳栽培菌株進行研究分析[5]，為初步篩出適合遼寧省地區(qū)栽培，且產(chǎn)量高、品質(zhì)好、抗病性強的黑木耳品種。為進一步研究栽培關(guān)鍵技術(shù)鑒定了前期基礎(chǔ)，更為遼寧省黑木耳遺傳育種提供的理論和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試黑木耳菌株共14個，名稱及來源見表1。

表1 14個供試黑木耳菌株來源Tab.1 14 tested Auricularia auricula strains from different sources

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：去皮土豆200 g、磷酸二氫鉀2.0 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、硫酸鎂1.5 g、蛋白胨3 g、水1 000 mL；液體同工酶試驗培養(yǎng)基：去皮土豆200 g、磷酸二氫鉀3.0 g、葡萄糖20 g、硫酸鎂 1.5 g、維生素B12 g、蛋白胨3 g、水1 000 mL；栽培配方：硬雜木屑86%、麥麩10%、豆粉2%、石膏1%、石灰1%。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌絲的特性試驗

1）固體菌落特征：將活化后的黑木耳菌種接種到平板培養(yǎng)基內(nèi)進行培養(yǎng)，每個品種5個重復(fù)，24℃避光培養(yǎng)5 d～8 d；每天定時查看菌絲的生長情況，當(dāng)菌種已經(jīng)長滿整個平板時，比較各菌種菌絲生長勢和測量菌落直徑，計算出菌絲的生長速度。

2）液體發(fā)酵特征：將活化后的黑木耳菌種接種到液體PDA培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，每個品種5個重復(fù)，23℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150 r·min-1；觀察菌絲萌發(fā)時間、生長情況、平均滿瓶時間及菌絲生長均一性等，同時測定菌球大小、菌球密度、菌絲體干重等指標[6-8]。

菌球大?。弘S機取培養(yǎng)基中菌球30個～50個，置于培養(yǎng)皿中緊密排成1排，測量總直徑，求出菌球平均直徑，重復(fù)3次。

菌球密度：取10 mL培養(yǎng)液，按一定比例準確稀釋，搖勻后取一定量在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中攤勻，培養(yǎng)皿下墊方格紙，進行計數(shù)，求出每毫克培養(yǎng)液中菌球個數(shù)。每個處理重復(fù)3次。

菌絲體干重：將培養(yǎng)好的菌液，在離心機上3 000 r·min-1離心15 min，用蒸餾水洗滌菌球，再離心，然后將菌球置于60℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干至恒重，稱量。

1.3.2 拮抗試驗

每個平皿接種3個品種菌絲塊，按“品”字形排列，重復(fù)3次后，將14個品種接種到培養(yǎng)基平板上，做好標識，25℃恒溫避光培養(yǎng)10 d～15 d；當(dāng)培養(yǎng)基平板上的菌絲相互生長到彼此接觸時觀察菌絲接觸區(qū)并繼續(xù)培養(yǎng)，觀察不同品種之間是否出現(xiàn)拮抗現(xiàn)象。

1.3.3 同工酶試驗

1） 同工酶鑒定

將黑木耳品種14個分別接入液體培養(yǎng)基，25℃下黑暗培養(yǎng)15 d后，4℃離心，洗滌，過濾收集搖瓶中的菌絲體，并用無菌水沖洗干凈，濾紙吸干水分，稱取0.5 g菌絲體放入研缽中，加入適量液氮充分研磨后，裝入離心管中，加入等量研磨液，于4℃、10 000 r·min-1離心15 min。棄去沉淀取上清，置于2 mL離心管中，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

在4℃條件采用垂直平板聚丙烯酰胺電泳，將上清液加等體積40%蔗糖溶液，點樣量為30 uL[6]。以溴酚蘭為指示劑，初始電壓為100 V，進入分離膠后加大電壓為150 V，電泳結(jié)束蒸餾水沖洗膠板，25℃染色 30 min，出褐色的清晰酶帶后漂洗數(shù)次，10%醋酸脫色固定，4℃條件下避光保存[9]。

2） 數(shù)據(jù)處理

計算電泳所得全部酶帶的相對遷移率，出現(xiàn)的酶帶記為1，不出現(xiàn)的為0，進行統(tǒng)計。利用數(shù)據(jù)軟件DPS 7.05進行處理，利用數(shù)據(jù)系統(tǒng)聚類對其進行分析并繪制出聚類樹狀圖。

1.3.4 栽培試驗

1） 袋料制作

采用17 cm×33 cm×0.005 mm常壓高密度聚乙烯塑料袋栽培，每袋裝干料約為600 g[10-11]。按配方準確稱取主料、輔料，并將玉米芯等原料混合均勻，再將石膏充分溶于水中，噴灑在料堆上，攪拌均勻。拌勻時要求拌2遍后用噴灑適量的水，一邊加水一邊攪拌確保培養(yǎng)料均勻混合，濕度一致。培養(yǎng)料含水量要求達到60%左右為佳，衡量的標準要手抓料握緊后，手指縫中能看見有水但不滴落為宜，此時手松開后料不散結(jié)成團，自然放下觸地即散[12]。

2）滅菌

采用常壓蒸汽滅菌鍋滅菌，需迅速升溫以避免時間太長導(dǎo)致培養(yǎng)料變酸；100℃條件下滅菌12 h～14 h，當(dāng)溫度降至到60℃以下時再取出，確保培養(yǎng)料熟化更加徹底。整個滅菌過程中確保搬運中輕拿輕放，避免菌袋破損造成污染[13]。

3） 接種培養(yǎng)

菌袋冷卻到30℃以下開始接種，采用液體菌種接種法。接種前對接種室進行徹底消毒殺菌處理，控制溫度低于30℃。首先將接種管和接種槍連接好，用10層的紗布包緊，高壓蒸汽滅菌，在0.12 Mpa條件下滅菌40 min[14]。菌種要求接到料袋的中口內(nèi)，這樣接的菌種能夠縮短養(yǎng)菌時間，每袋接種量都定量為15 mL。接種后菌袋要及時移入養(yǎng)菌室，養(yǎng)菌室內(nèi)要保持清潔干燥、保溫、通風(fēng)良好。發(fā)菌前要對養(yǎng)菌室進行充分消毒再投入使用。將接種好的菌袋擺放到事先處理好的架子上，要注意輕拿輕放，擺放的層數(shù)不宜過高一般不要超過5層，用報紙蓋好。養(yǎng)菌期間要嚴格控制好養(yǎng)菌室溫度，堅持做到低溫養(yǎng)菌，暗光培養(yǎng)。原則上應(yīng)做到“寧干勿濕”，溫度高時要用換氣扇來進行通風(fēng)換氣[15]。一般情況下，液體菌種在25℃培養(yǎng)，6 h后菌種萌發(fā)，35 d左右可長滿菌袋。養(yǎng)菌期間，如果發(fā)現(xiàn)菌袋內(nèi)有污染應(yīng)及時挑出進行單獨培養(yǎng)。菌袋內(nèi)溫度較高時，要及時把中間菌袋放到邊上，把上面菌袋放到下面，進行倒垛降溫。

每個品種的菌株栽培袋數(shù)量為200袋，按露地全光照標準栽培模式進行管理，定時扎眼、催芽，通過對菌絲長勢、污染代數(shù)、滿袋時間、從耳芽到耳片分化的時間、子實體形狀、產(chǎn)量和生育期（從接種次日到第一次采收的天數(shù)）等數(shù)據(jù)進行觀察和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲培養(yǎng)特性結(jié)果

黑木耳菌株在培養(yǎng)基上的生長狀況見表2。

表2 黑木耳菌株在培養(yǎng)基上的生長狀況Tab.2 The growth of Auricularia auricula strains on the cultivation medium

由表2可以看出，在固體平板培養(yǎng)基上M1、M2、M3、M8、M9、M12菌落長勢最好，菌絲潔白、粗壯、濃密，且無色素分泌，菌絲長速比其他菌株較快，都達到0.300 cm·d-1以上，其中M2菌絲長速差異顯著，其他5個菌株菌絲長速無明顯差異。黑木耳菌株在液體培養(yǎng)基上生長情況見表3。

由表3可看出，在液體培養(yǎng)基中各菌株菌絲體干重差異顯著，M1、M2、M3、M8、M9、M12菌絲體干重較大，都達到了2.00 mg·mL-1以上，同時這6個菌株的菌球較小，密度較大，且萌發(fā)時間早、培養(yǎng)時間較短，生長速度較快。綜合固體培養(yǎng)結(jié)果，初步確定M1、M2、M3、M8、M9、M12為優(yōu)良品種。

表3 黑木耳菌株在液體培養(yǎng)基上生長情況Tab.3 The mycelial growth of Auricularia auricula strains in the liquid cultivation medium

2.2 拮抗試驗結(jié)果

不同黑木耳菌株見到拮抗反應(yīng)結(jié)果見表4、圖1。

表4 不同黑木耳菌株間的拮抗反應(yīng)Tab.4 The antagonistic reaction among the different Auricularia auricula strains

由表4可以看出，供試的14個黑木耳菌株中，M1、M5、M7、M8、M9之間無拮抗反應(yīng)，M4與M11之間無拮抗，M12與M7、M9之間無拮抗，表明這幾個菌株間親緣關(guān)系較近，可能是同種異名。M2、M3、M6、M13、M14與其他菌株都沒出現(xiàn)拮抗反應(yīng)，說明M2、M3、M6、M13、M14與其他9個品種之間的親緣關(guān)系較遠可能為獨自的品種。

2.3 同工酶試驗結(jié)果

14個黑木耳菌絲體酯酶同工酶電泳（圖譜）和14個黑木耳菌絲體酯酶同工酶譜帶（Rf值）分別見圖2、表5。

由圖2可知，14個黑木耳菌株共檢測出酶帶數(shù)目達到14條，酶譜帶數(shù)多為3條～10條，其中多數(shù)的有4條。由表5可知，Rf（相對遷移率） 0.605為14個菌株所共有，可以認為是黑木耳的基礎(chǔ)酶譜帶，這表明14個黑木耳品種間存在著一定的親緣關(guān)系。個別菌株存在各自特征的酶帶，如Rf=0.346，就是M3菌株的特征帶；Rf=0.292則為M14菌株的特征帶。M7和M9菌株的酶帶大體相同，只是寬窄、顏色略有不同，說明它們的酶活力有所區(qū)別，但菌株間具有著相同的遺傳基礎(chǔ)。

表5 14黑木耳菌株酯酶同工酶的Rf值Tab.5 The Rf values of esterase isozymes about 14 tested Auricularia auricula strains

利用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件計算14個黑木耳菌株酶譜之間的聯(lián)合系數(shù)，并對所得的酶帶進行聚類系統(tǒng)分析，聚類分析樹狀圖見圖3。

由圖3可知，在相異水平70%左右時，可以把這14個菌株分成4類：第一類包括M1、M2、M5、M7、M8、M9、M12、M13這8個菌株；第二類包括M4、M6、M10、M11這4個菌株；第三類為M14菌株；第四類為M3菌株，M14和M3這兩個菌株與其它菌株親緣關(guān)系遠，自成一類。M7、M9和M12菌株；M4和M11菌株幾乎沒有差異，可斷定為同種異名。聚類分析結(jié)果與形態(tài)特征基本趨同。

2.3.1 栽培試驗

1） 發(fā)菌期調(diào)查

發(fā)菌期菌絲生長速度見圖4。

由圖4可以看出，M2、M3兩個菌株的菌絲生長速度最快，滿袋時間最短，并且菌絲濃白，生長旺盛，長勢較強；其他菌株生長速度較慢，長勢稍差。

2） 出耳期調(diào)查

發(fā)菌期性狀調(diào)查詳見表6。

由表6可看出， M2、M9、M12原基形成早，生育期短，屬于早熟品種，污染率低，抗性好，產(chǎn)量高，差異不顯著，都達到45 g/袋左右，耳片厚且干濕比較大，但是耳片呈菊花狀、多筋，商品性較差；M3、M8原基形成較早，生育期較短，屬于中早熟品種，污染率低，抗性好，產(chǎn)量較M2、M9、M12低些，但是耳片呈碗狀或耳狀，少筋或半筋，耳片厚且干濕比較大，顏色深黑，商品性好，所以選擇這兩個品種作為適合遼寧地區(qū)栽培的優(yōu)良品種。

表6 各黑木耳菌株農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量的比較Tab.6 Comparison of Auricularia auricula varieties strains in some of agronomic characters

3 討論與結(jié)論

3.1 菌株同種異名現(xiàn)象較為嚴重

鑒別不同菌株的傳統(tǒng)方法是利用拮抗試驗來驗證，不同品種菌絲間的拮抗反應(yīng)是菌株之間不同遺傳特性的表現(xiàn)[16]。通過14個不同黑木耳菌株之間的拮抗試驗，來證明各菌株間可能存在著同種異名的現(xiàn)象?？偨Y(jié)原因有以下幾點：一是可能同一品種在不同地區(qū)的命名不同，又相互進行引種造成的；二是因為不同地區(qū)的相同菌株，通過其生長環(huán)境變化而造成生長性狀上的差異；三是菌種監(jiān)管不規(guī)范，個別單位引種后經(jīng)過純種分離后隨意命名，導(dǎo)致同種異名現(xiàn)象十分嚴重。這種情況給菇農(nóng)選擇菌種和科研單位進行育種研究工作帶來許多不便，影響食用菌菌種市場的正常秩序。

3.2 黑木耳菌株菌絲生長特性和生物學(xué)效率存在明顯差異

通過拮抗試驗證明不是同一品種的菌株，并不能確定就是優(yōu)良菌株，要進一步進行行菌絲生長測定、栽培試驗綜合評價后才能確定。從菌絲的培養(yǎng)特性，生物學(xué)效率兩個方面來觀察測定。如果出現(xiàn)差異，也有可能是由于同一品種菌株的來源不明或者是轉(zhuǎn)代次數(shù)過多而導(dǎo)致的。

從菌絲生長速度和長勢觀察分析，兩者并不一定是嚴格對應(yīng)的。同工酶就是利用具有相同或者相似的某種催化功能，但酶分子的結(jié)構(gòu)有所不相同的一組酶。同工酶酶譜主要是指有編碼的各條酶帶基因直接決定的，其所表達出來的是分子水平的信息[17]。同工酶分析作為一種分子遺傳標記的技術(shù)手段，目前已經(jīng)逐漸成為真菌這一領(lǐng)域常用且重要的研究工具，特別是在屬內(nèi)菌種之間并且在品種間的分類鑒定中起到了十分有效的作用。

食用菌同一品種的菌絲體酯酶同工酶帶的位置、寬窄、數(shù)目都是完全相同的。可能酶帶的顏色深淺略有不同；而不同品種之間的酯酶同工酶圖譜是不同的[18]。本研究中的14個黑木耳菌株的酯酶同工酶酶譜有著相同點的，即為基礎(chǔ)酶譜帶；又各自具有自身獨特的酶帶特征，即為特征酶譜帶，可反映出不同菌株間的相互聯(lián)系和差異。同工酶帶越多品系越進化的觀點，多一條酶帶，就多一個特性或是成分中就多一種適應(yīng)能力，所以特征酶帶是一種進化的表現(xiàn)，這為黑木耳品種優(yōu)劣的鑒定提供了重要依據(jù)[19-21]。

酯酶作為一個生化指標，能夠反映出供試的菌株在遺傳特性上的某種、某些差異。但要是培養(yǎng)條件各不相同，也同樣會導(dǎo)致酯酶同工酶的差異性明顯。因此在利用酯酶同工酶電泳技術(shù)對食用菌食品種進行分類或是鑒定時，試驗的菌種必須是在環(huán)境條件相同的條件下培養(yǎng)得到的。

通過拮抗試驗、菌絲培養(yǎng)特性觀察和同工酶試驗3種不同的試驗方法，結(jié)合14個黑木耳菌株全光照露地栽培模式下從發(fā)菌期、出耳期及其產(chǎn)量的各種指標中篩選出綜合性狀良好、商品質(zhì)量佳的菌株M3（黑3） 和M8（黑狀元），比較適合遼寧本地區(qū)進一步栽培推廣應(yīng)用。在14個品種中，M4和M11雖然生育期長，產(chǎn)量不高，但是具有良好的商品性狀，可作為商品性狀好的育種材料，為下一步優(yōu)良種質(zhì)保護和遺傳育種工作提供參考依據(jù)。