葉志強(qiáng)，郭貴龍，陳涵斌，呂奇原，谷甸娜

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000，1.外科，2.放化療科）

胰腺癌是目前已知惡性程度最高的腫瘤之一，五年生存率只有5%左右，其病死率基本接近腫瘤的發(fā)生率[1]。其早期診斷困難、易于侵襲轉(zhuǎn)移，現(xiàn)在仍缺乏有效的診治方法。目前，手術(shù)雖是根治胰腺癌的首要手段，但絕大部分胰腺癌患者在被診斷時(shí)已局部進(jìn)展或者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，因此只能接受放化療。然而，胰腺癌對(duì)放化療并不敏感，表現(xiàn)為明顯的治療抵抗。其中腫瘤細(xì)胞放療后再增殖是導(dǎo)致放療抵抗，引起治療失敗的一個(gè)重要原因[2]。因此，如能抑制放療后再增殖將能一定程度減少腫瘤細(xì)胞的放療抵抗。放療的關(guān)鍵靶點(diǎn)是細(xì)胞的DNA。放射線引起DNA損傷后，機(jī)體會(huì)啟動(dòng)損傷應(yīng)答通路，這種通路的激活將會(huì)阻滯細(xì)胞周期，可以讓受損腫瘤細(xì)胞有足夠的時(shí)間來(lái)進(jìn)行自我修復(fù)，繼而產(chǎn)生放療抵抗，而加速再增殖與腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力有關(guān)。近年來(lái)報(bào)道，DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄子4（DNA damage inducible transcript 4，DDIT4）可參與應(yīng)激、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞凋亡等多種生命過(guò)程，并在乳腺癌、前列腺癌和胃癌等腫瘤中表達(dá)增高[3]。那DDIT4有否通過(guò)影響DNA損傷修復(fù)進(jìn)而影響放療后再增殖呢？另外，腫瘤細(xì)胞在接受放療后會(huì)出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡，細(xì)胞死亡后會(huì)釋放多種細(xì)胞內(nèi)容物，包括DNA、RNA和蛋白等。已有研究表明miRNA可通過(guò)影響DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤組織微環(huán)境等因素調(diào)控腫瘤輻射敏感性[4]。據(jù)報(bào)道m(xù)iR-7可通過(guò)抑制EGFR-PI3K-AKT信號(hào)通路改善肺癌、乳腺癌、頭頸部腫瘤及膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放療敏感性[5]，而且我們前期研究發(fā)現(xiàn)miR-7-5p可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖促進(jìn)凋亡[6]，那么miR-7-5p可否抑制放療后再增殖呢？因此，本研究通過(guò)建立的胰腺癌細(xì)胞放療后再增殖模型，研究瀕死細(xì)胞釋放的miR-7-5p對(duì)放療后再增殖效應(yīng)的影響，并從分子水平探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，使用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞倍增時(shí)間決定傳代時(shí)間，用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2 慢病毒包裝

在6孔板中接種3×105個(gè)293細(xì)胞，加入2 mL DMEM完全培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，按照Lipofectamin 2000脂質(zhì)體說(shuō)明書，將三質(zhì)粒系統(tǒng)（pLEXGFP-luc2、psPAX2和pMD2.G）共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，收集培養(yǎng)上清液。4 ℃ 3 000 g離心10 min，去除細(xì)胞碎片，然后將上清用0.45 μm的PVDF濾膜過(guò)濾，-80 ℃分裝保存。

1.3 慢病毒感染和穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建

感染前24 h將細(xì)胞以每孔1×105密度接種于6孔板中含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后長(zhǎng)至50%左右進(jìn)行慢病毒感染，在6孔板中加入已濾病毒液，于5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，病毒感染48 h后使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，感染細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光，使用添加嘌呤霉素的10%FBS DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶-綠色熒光蛋白（Fluc-GFP）的PANC-1細(xì)胞，記作PANC-1-LUC細(xì)胞。后續(xù)通過(guò)檢測(cè)PANC-1-LUC細(xì)胞的熒光素酶活性，反映細(xì)胞增殖的情況[7]。

1.4 PANC-1細(xì)胞放療后再增殖模型構(gòu)建及分組

待PANC-1細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)分裂期后，將其鋪于實(shí)驗(yàn)所需的孔板中，次日使用線性加速器給予單次10 Gy放射線處理細(xì)胞。接著將放療后的腫瘤細(xì)胞當(dāng)天消化計(jì)數(shù)，接種于24孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。24 h后，將穩(wěn)定表達(dá)Fluc-GFP的PANC-1-LUC細(xì)胞接種于24孔板上的Transwell培養(yǎng)室（0.4 μm孔徑）內(nèi)進(jìn)行共培養(yǎng)，根據(jù)處理方法不同分為3組：PANC-1-LUC+PANC-1（10 Gy）組、PANC-1-LUC+PANC-1（0 Gy）組及PANC-1-LUC組。當(dāng)研究受輻照細(xì)胞對(duì)PANC-1-LUC細(xì)胞輻照后損傷修復(fù)等影響時(shí)，給予PANC-1-LUC細(xì)胞單次2 Gy照射，分為2組：PANC-1-LUC（2 Gy）+PANC-1（10 Gy）組與PANC-1-LUC（2 Gy）+PANC-1（0 Gy）組。根據(jù)實(shí)驗(yàn)指定時(shí)間點(diǎn)，向24孔板中加入熒光素酶底物，利用小動(dòng)物活體成像儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成像。

1.5 Real-time PCR檢測(cè)miRNA-7-5P的表達(dá)水平

采用miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit（Qiagen）提取上清液中的miRNA，按照PrimeScriptTMRT reagent kit（TakaRa）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在QuantStudio 6 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中，使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒，量化miRNA-7-5P的表達(dá)水平。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡

用胰酶消化后收集細(xì)胞，在預(yù)冷的75%乙醇固定過(guò)夜，加入PI/RNase常溫染色30 min，PBS洗滌，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，使用Modfit軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。凋亡采用PE標(biāo)記的Annexin-V和7-AAD凋亡試劑盒，各加5 μL，室溫孵育30 min，再用PBS洗滌，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.7 雙熒光素酶法驗(yàn)證miR-7-5p靶基因?yàn)镈DIT4

利用Targetscan軟件對(duì)miR-7-5p的靶向基因進(jìn)行預(yù)測(cè)篩選，預(yù)測(cè)了與輻射損傷修復(fù)相關(guān)基因DDIT4為其下游靶基因。設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增靶基因DDIT4-3'UTR序列的引物如下：Forward 5'-TCAGAGCTCA CTTCAACCTGAGGGGGCCGACA-3’；Reverse 5'-G TGGCTAGCTGTTTTAACAAACATGTTTATTAG-3'。并將合成的DDIT4-3'UTR、野生型（WT）序列及突變型（MT）序列進(jìn)行退火，對(duì)DDIT4-3'UTR、野生型及突變型用SacI/NheI雙酶切，構(gòu)建pmirGLO（Promega）雙熒光報(bào)告質(zhì)粒，所得重組質(zhì)粒均經(jīng)測(cè)序鑒定。將miR-7-5p mimics與對(duì)照空載體、克隆有3'UTR序列或?qū)?yīng)的WT、MT序列的報(bào)告質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染進(jìn)入PANC-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參，檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性的相對(duì)值，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果。

1.8 Western blotting檢測(cè)γH2A.X與DDIT4蛋白

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，使用加有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液RIPA收集蛋白，冰上裂解40 min后離心15 min，收集上清即為蛋白樣品。采用SDS-PAGE電泳法對(duì)提取的蛋白進(jìn)行電泳分離，然后印跡于PVDF膜上。膜在5%脫脂牛奶中封閉1 h，加入一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜，在室溫下，將膜與HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h，洗膜后顯影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，計(jì)量資料兩組間均數(shù)比較采用Student'st檢驗(yàn)，多組間均數(shù)分析采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受輻照PANC-1（10 Gy）細(xì)胞對(duì)PANC-1-LUC細(xì)胞加速再增殖及DNA損傷修復(fù)的影響

受輻照PANC-1（10 Gy）細(xì)胞在放療后第3天明顯抑制了PANC-1-LUC細(xì)胞的生長(zhǎng)，且這個(gè)抑制效應(yīng)在第5天才消除，此后與受輻照PANC-1（10 Gy）細(xì)胞共培養(yǎng)的PANC-1-LUC細(xì)胞進(jìn)入快速的增殖階段，表現(xiàn)為明顯的再增殖效應(yīng)（圖1）。與此同時(shí)，我們觀察到受輻照PANC-1（10 Gy）細(xì)胞能明顯促進(jìn)PANC-1-LUC（2 Gy）細(xì)胞放療后γH2A.X的消退，提示受輻照PANC-1（10 Gy）細(xì)胞促進(jìn)了X線照射后細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)（圖2）。

圖1 受輻照PANC-1（10 Gy）細(xì)胞促進(jìn)PANC-1-LUC胰腺癌細(xì)胞加速再增殖

2.2 受輻照PANC-1（10 Gy）細(xì)胞對(duì)PANC-1-LUC（2 Gy）細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響

與PANC-1-LUC（2 Gy）+PANC-1（0 Gy）組相比，PANC-1-LUC（2 Gy）+PANC-1（10 Gy）組不僅抑制了存活PANC-1-LUC（2 Gy）細(xì)胞的凋亡（圖3），此外還增加了PANC-1-LUC（2 Gy）細(xì)胞G0/G1期的阻滯（圖4）。

圖2 受輻照PANC-1（10 Gy）細(xì)胞促進(jìn)PANC-1-LUC（2 Gy）細(xì)胞放療后DNA損傷修復(fù)

圖3 與受輻照PANC-1（10 Gy）細(xì)胞共培養(yǎng)抑制放療后PANC-1-LUC（2 Gy）細(xì)胞凋亡

圖4 與受輻照PANC-1（10 Gy）細(xì)胞共培養(yǎng)增加PANC-1-LUC（2 Gy）細(xì)胞的G0/G1周期阻滯

2.3 miR-7-5p表達(dá)上調(diào)可抑制PANC-1-LUC（2 Gy）細(xì)胞放療后加速再增殖

我們利用RT-PCR方法檢測(cè)受輻照PANC-1（10 Gy）細(xì)胞上清液中miR-7-5p的表達(dá)情況，結(jié)果提示miR-7-5p在受輻照PANC-1（10 Gy）細(xì)胞的上清中明顯表達(dá)下調(diào)（t=16.9，P＜0.01）。有研究報(bào)道m(xù)iR-7-5p具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，而我們也在放療處理后的細(xì)胞上清中檢測(cè)到miR-7-5p釋放減少。因此，我們猜想是否因放療抑制的miR-7-5p促進(jìn)了殘余腫瘤細(xì)胞增殖，從而參與了腫瘤細(xì)胞再增殖。為了證實(shí)我們的猜想，我們往再增殖模型中加入miR-7-5p mimics，觀察是否對(duì)腫瘤再增殖有影響。成像結(jié)果顯示，PANC-1-LUC（2 Gy）+PANC-1（10 Gy）+miR-7-5p mimics組的熒光素酶活性明顯低于PANC-1-LUC（2 Gy）+PANC-1（10 Gy）組（P＜0.01） （圖5）。因此，我們認(rèn)為提高miR-7-5p水平能夠顯著抑制PANC-1細(xì)胞放療后再增殖。

2.4 miR-7-5p在胰腺癌細(xì)胞中通過(guò)靶向DDIT4促進(jìn)放療后加速再增殖

圖5 上調(diào)miR-7-5p水平抑制胰腺癌細(xì)胞放療后加速再增殖

為了探究miR-7-5p調(diào)控胰腺癌細(xì)胞放療后加速再增殖的分子機(jī)制，我們利用生物信息學(xué)方法，獲得miR-7-5p的潛在靶基因，并根據(jù)Targetscan篩選出與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的DDIT4基因，我們用雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。在DDIT4-3'-UTR和野生型WT組中，miR-7-5p mimics的加入使胰腺癌PANC-1細(xì)胞中熒光值顯著降低（3'-UTR組：t=12.6，P＜0.01；WT組：t=10.8，P＜0.01）。在DDIT4突變型MT組中，PANC-1細(xì)胞熒光值未見(jiàn)顯著變化（t=1.01，P＞0.05），證明胰腺癌細(xì)胞中通過(guò)miR-7-5p靶向DDIT4基因發(fā)揮調(diào)控作用（圖6A～B）。進(jìn)一步，我們通過(guò)West-ern blotting證實(shí)在轉(zhuǎn)染miR-7-5p mimics的PANC-1細(xì)胞中，DDIT4蛋白明顯抑制，反之，轉(zhuǎn)染miR-7-5p inhibitor可上調(diào)PANC-1細(xì)胞DDIT4蛋白的表達(dá)（圖6C）。所以，miR-7-5p在胰腺癌細(xì)胞中靶向調(diào)控DDIT4分子。

圖6 miR-7-5p在胰腺癌細(xì)胞中靶向調(diào)控DDIT4分子

接著，我們進(jìn)一步利用Western blotting檢測(cè)放療后共培養(yǎng)時(shí)DDIT4分子及凋亡信號(hào)的表達(dá)水平。與PANC-1-LUC（2 Gy）+PBS組相比，PANC-1-LUC（2 Gy）+PANC-1（10 Gy）組DDIT4蛋白表達(dá)明顯升高，并且抑制了凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。反之，在培養(yǎng)上清液中加入miR-7-5p mimics則可抑制DDIT4信號(hào)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（圖7A～B）。

3 討論

幾十年來(lái)盡管臨床上一直強(qiáng)調(diào)應(yīng)重視腫瘤加速再增殖現(xiàn)象，但至今對(duì)于腫瘤放療加速再增殖的機(jī)制尚未完全清楚。放療過(guò)程中，由于受到組織增殖動(dòng)力學(xué)及細(xì)胞周期的影響，腫瘤細(xì)胞受到照射后會(huì)在放療后期出現(xiàn)增殖加速。研究證實(shí)，細(xì)胞周期、DNA損傷修復(fù)機(jī)制和蛋白調(diào)節(jié)等多種信號(hào)通路可能與加速再增殖有關(guān)[8]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)放療后的瀕死細(xì)胞可以通過(guò)SHH-Wnt信號(hào)[9]，活化caspase-3/7-PKCδ信號(hào)[10]，以及上調(diào)Sox211等刺激胰腺癌存活細(xì)胞加速再增殖。我們既往研究也曾報(bào)道，放療后瀕死細(xì)胞可通過(guò)miR-193a調(diào)控TGF-β2/TGF-βRIII信號(hào)通路促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞放療后再增殖[7]。

本研究通過(guò)經(jīng)熒光素酶標(biāo)記的胰腺癌細(xì)胞PANC-1-LUC建立了胰腺癌細(xì)胞放療后加速再增殖模型，我們發(fā)現(xiàn)接受單次輻照PANC-1（10 Gy）細(xì)胞，在放療后3天明顯抑制了存活的PANC-1-LUC胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，且這個(gè)抑制效應(yīng)在第5天才得以解除，之后進(jìn)入快速的增殖階段，熒光強(qiáng)度明顯增加，這提示加速再增殖現(xiàn)象的存在。進(jìn)一步地，檢測(cè)比較經(jīng)輻照與未輻照處理后的細(xì)胞上清液中miR-7-5p的表達(dá)情況，結(jié)果顯示受輻照PANC-1（10 Gy）細(xì)胞上清液中miR-7-5p明顯下調(diào)，提示miR-7-5p在放療后加速再增殖中起了重要作用。既往研究報(bào)道，miR-7在多種實(shí)體腫瘤中如肝癌[12]、肺癌[13]、乳腺癌[14]、胃癌[15]等多種腫瘤生物學(xué)過(guò)程中起到重要的抑制作用，并且可改善乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、喉鱗狀細(xì)胞癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放療敏感性[16-17]。而我們先前在胰腺癌中的研究，也證實(shí)miR-7-5p可抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖、阻滯細(xì)胞周期，提示miR-7-5p在胰腺癌中亦起到抑癌作用[6]，那miR-7-5p是怎么影響放療后加速再增殖的呢？本研究將受輻照PANC-1（10 Gy）細(xì)胞的上清液中補(bǔ)充miR-7-5p mimics與PANC-1-LUC（2 Gy）細(xì)胞共培養(yǎng)，相比于PANC-1-LUC（2 Gy）組，PANC-1-LUC（2 Gy）+PANC-1（10 Gy）+miR-7-5p mimics組細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯減少，同時(shí)發(fā)現(xiàn)存活細(xì)胞中miR-7-5p的靶基因DDIT4信號(hào)蛋白也明顯受抑制。

電離輻射等會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定程度的DNA損傷，細(xì)胞內(nèi)某些機(jī)制將促使發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，使細(xì)胞有足夠時(shí)間完成損傷修復(fù)或DNA復(fù)制，從而維持基因組的穩(wěn)定，但這正是細(xì)胞放射抵抗的重要原因[18]。而DDIT4是一種DNA損傷誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，既往研究報(bào)道，在胃癌中，DDIT4可通過(guò)影響p53和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路[19]，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和胃癌的發(fā)生。在膀胱癌中，DDIT4促進(jìn)癌細(xì)胞增殖減少凋亡[20]。此外，DDIT4可介導(dǎo)腫瘤自噬促進(jìn)腫瘤存活，并與卵巢癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[21-22]。在本研究中，放療后瀕死細(xì)胞上清液中miR-7-5p表達(dá)減少，使存活胰腺癌細(xì)胞中DDIT4顯著上調(diào)，通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)阻滯和細(xì)胞凋亡來(lái)保持基因組完整性，促進(jìn)了放療后加速再增殖。反之，當(dāng)上清液中miR-7-5p上調(diào)，存活胰腺癌細(xì)胞中DDIT4表達(dá)下調(diào)，則抑制DNA損傷修復(fù)，抑制胰腺癌細(xì)胞放療后再增殖。

圖7 miR-7-5p通過(guò)抑制DDIT4促進(jìn)放療后PANC-1-LUC（2 Gy）細(xì)胞凋亡

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)放療后胰腺癌細(xì)胞可通過(guò)下調(diào)miR-7-5p促進(jìn)DDIT4表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡及調(diào)控細(xì)胞周期再分布來(lái)加速再增殖，表明提高miR-7-5p的水平能夠提高胰腺癌細(xì)胞的放療敏感性，這將為改善胰腺癌放療抵抗提供了一種新的思路和方法。