薛瑞豐，湯寧，，潘晨燕，董春龍，蔡佳暉，袁獻溫，王經琳，，，任昊楨，，，施曉雷，，

（1.南京醫(yī)科大學附屬鼓樓臨床醫(yī)學院 普外科，江蘇 南京 210005；2.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院 普外科，江蘇 南京 210008；3.南京中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合鼓樓臨床醫(yī)學院 普外科，江蘇 南京 210029）

肝臟是參與能量合成，儲存代謝的中心器官，具有強大的再生能力，增強肝臟的再生能力對肝臟疾病患者具有重要意義[1]。肝祖細胞是位于肝臟Hering區(qū)域的、具有向肝膽管上皮細胞和肝細胞分化能力的一類干細胞[2-3]。在輕度損傷的肝臟中，肝再生通常是以肝細胞的增殖和肥大來實現(xiàn)[4-5]。而當肝細胞增殖受到抑制或者肝臟損傷嚴重的情況下，肝祖細胞會分化為肝細胞和膽管上皮細胞，促進肝再生[6-7]。肝祖細胞從受損區(qū)域的門靜脈向外擴展，形成導管樣的簇狀結構，稱為導管反應[8]。研究證明，在慢性肝臟疾病中，肝祖細胞能介導肝再生。而肝臟類器官具有分化成功能性肝細胞、保護肝細胞和促進肝再生的作用[9]。那么在急性肝臟損傷如肝部分切除術后，外源性植入肝臟類器官是否發(fā)揮類似肝祖細胞的促進肝臟再生作用？目前尚無相關的報道。本研究基于這個問題進行初步的探討。

1 材料和方法

1.1 類器官的構建

6～8周齡雄性C57BL/6小鼠肝臟在預冷DMEM/F-12培養(yǎng)基（Glibco）中剪碎至1 mm大小，轉移離心管中靜置去上清，加入消化液（Dispase、Collagenase type IV、Advance DMEM F12按1：1：6配比）10 mL，37 ℃水浴消化20 min，機械吹打靜置去上清。繼續(xù)重復消化，收集后面5次的組織上清液。分別用100、30 μm細胞篩網過濾，收集30 μm篩網截留的肝細胞。300 g，5 min離心收集細胞沉淀，基質膠重懸細胞種板，加入750 μL肝臟類器官誘導培養(yǎng)基hepaticult OGM mouse Supplement，于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）

從類器官中提取總RNA，將純化的RNA反向轉錄成cDNA，應用生物系統(tǒng)7500快速實時PCR系統(tǒng)進行定量。資料采用2-ΔΔCT法進行分析。使用的引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 免疫熒光檢測CK8、Desmin、AFP、PCNA表達情況

制作類器官冰凍切片進行鑒定。將切片先吹干，室溫下多聚甲醛固定20 min，1×PBS洗3次，封閉液室溫封閉1 h，一抗4 ℃過夜，清洗3次，避光孵育二抗，清洗3次，對細胞核進行染色，清洗3次，封片。熒光顯微鏡下觀察。一抗分別是兔抗鼠CK8、Desmin、單克隆鼠源性AFP、兔抗鼠PCNA，二抗分別是山羊抗小鼠IgG H&L和山羊抗兔IgG H&L。

1.4 小鼠70%肝切模型的建立及肝臟類器官移植

雄性C57BL/6小鼠6～8周齡，隨機分為2組，每組18只，以肝切除術后第1、4、7天為觀察時間點，每個時間點6只[10]。對照組：行肝左、中葉切除術（占全肝70%）+肝包膜注射200 μL PBS；治療組：行肝左、中葉切除術（占全肝70%）+肝包膜移植200 μL類器官懸液（1×106）。肝包膜下移植類器官方法如下：用鈍性鑷子提起肝包膜，用注射器將約400 μL的0.9%氯化鈉注入肝包膜下，使其肝包膜和肝實質表明分離，再將其抽回，將200 μL肝臟類器官懸液注入肝包膜下。觀察有無出血、漏液，縫合皮膚[11]。于術后第1、4、7天處死小鼠，取肝臟，用10%中性甲醛固定，石蠟包埋用于進一步組織學分析。

1.5 HE染色和免疫組化分析檢測Ki67

取石蠟包埋的肝組織切片5 μm用蘇木精和伊紅（HE）染色進行形態(tài)學檢查，用Ki67（abcam）進行免疫組化評估肝臟再生增殖情況。

1.6 Western blotting檢測PCNA蛋白水平

剪取適宜肝臟組織，置于磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和RIPA一定比例混合的蛋白裂解液，于冰上研磨后離心取蛋白上清。BCA法測蛋白濃度后，取20～30 μg蛋白加樣，經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并將其轉移至PVDF膜上，于5%脫脂奶粉中搖床封閉1～2 h，將PVDF膜置于一抗PCNA、4 ℃孵育過夜，用Tris緩沖洗膜3次，10 min/次，再用二抗室溫孵育2 h，Tris緩沖鹽水加吐溫洗膜3次，10 min/次。凝膠成像系統(tǒng)顯色曝光，用Imaje J對結果進行灰度分析。

1.7 肝功能評估

小鼠70%肝切模型建立后，于術后第1、4、7天摘除眼球取血，同時收取正常未手術小鼠血樣標本作為正常組。用南京大學附屬鼓樓醫(yī)院自動化生化分析儀測定谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、白蛋白（albumin，ALB）水平。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 類器官構建

肝臟類器官具有高度克隆性，在特定的培養(yǎng)條件下，可以從少量起始細胞快速擴增，且擴增后的肝臟類器保留了分為成熟肝細胞的能力[12]。因此我們首先從細胞形態(tài)方面觀察，發(fā)現(xiàn)肝細胞經3天誘導懸浮培養(yǎng)后從直徑20 μm左右囊性結構聚集組裝形成125 μm的類器官（P＜0.05），直徑擴增近6倍。當類器官直徑超過200 μm時，類器官逐漸出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象。因此在皺縮發(fā)生前，類器官能保持較好的傳代活力。由此可見，我們構建的肝臟類器官具有較強的自我增殖和組裝能力。見圖1。

圖1 肝臟類器官形態(tài)及其細胞直徑量化

2.2 肝臟類器官表型鑒定

類器官培養(yǎng)技術開始于腸道組織的研究，之后迅速在其他器官中應用普及，Huch等[13]從人源性肝臟中分離出EPCAM（+）上皮細胞和肝細胞，體外三維培養(yǎng)，EPCAM（+）的上皮細胞大量擴增為肝臟類器官，在擴增過程中保持高度的遺傳穩(wěn)定性，且具有雙分化潛能，可分化為肝細胞和膽管細胞。因此我們將傳代前后的類器官與肝組織進行對比，發(fā)現(xiàn)類器官中肝臟干細胞的標志基因EPCAM、SOX9和CK19較肝組織呈明顯上調（P＜0.05），且傳代前后EPCAM、SOX9、CK19、TBX3、AFP、SOX17、FOXA2、HNF4A、CEBPA和CEBPB未見明顯改變。免疫熒光發(fā)現(xiàn)CK8和Desmin、AFP、PCNA呈陽性表達，說明肝臟類器官具有肝臟上皮細胞部分屬性和增殖能力。由上述結論可以證明：我們成功將肝細胞誘導成具有肝臟干細胞屬性和增殖能力的肝臟類器官。見圖2。

2.3 肝臟類器官移植能保護70%肝切除術后的肝細胞，促進肝再生

圖2 肝臟類器官表型鑒定

HE顯示對照組和治療組小鼠在術后第1天肝索結構消失，細胞排列紊亂，炎性細胞浸潤，存在大量的脂肪空泡，且治療組肝臟脂肪空泡更嚴重。再生的第4天，對照組小鼠肝細胞核仁染色加深，仍有炎性細胞浸潤，部分區(qū)域存在肝細胞壞死區(qū)。治療組小鼠肝細胞形態(tài)大小基本恢復正常，形態(tài)較清晰，無炎癥細胞浸潤，無脂肪或氣球樣變。在術后第7天，兩組小鼠肝再生結束，小鼠肝細胞呈條索狀規(guī)則，肝血竇間隙清晰，肝細胞形態(tài)大小正常，無脂肪或氣球樣變，Ki67結果顯示，70%肝切除術后第1天，對照組小鼠增殖明顯強于治療組，第4天兩組均顯示增殖狀態(tài)，為了確認在70%肝切除術后第4天增殖狀態(tài)的差異，我們通過Western blotting檢測PCNA水平再一次確認，量化結果顯示在術后第4天治療組增殖顯著上調，接近對照組3倍（P＜0.05）。這說明肝臟類器官有促進肝細胞增殖作用。見圖3。

圖3 肝臟損傷及增殖情況

2.4 肝臟類器官移植改善70%肝切除術后肝功能

既往研究表明，70%肝切除術后小鼠肝臟損傷嚴重，肝酶會顯著升高。因此我們對兩組小鼠70%肝切除術后肝功能進行檢測，發(fā)現(xiàn)術后第1天兩組ALT、AST、TBIL和DBIL均顯著升高，且治療組ALT高于對照組。但在術后第4天，治療組ALT、AST、總膽紅素（direct bilirubin direct，TBIL）和直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）明顯下降，同時肝臟ALB明顯升高（P＜0.05）。因此判斷肝臟類器官對70%肝切除術后小鼠肝功能有改善作用。見圖4。

圖4 肝功能相關指標隨時間恢復情況

3 討論

肝臟部分肝切除術之后，剩余功能正常的肝細胞會響應再生誘導信號如腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor-alpha，TNF-α）和白介素-6（interleukin-6，IL-6）等，在經過一周時間增殖再生恢復到器官的初始重量[14-15]。既往研究表明，在毒素介導的肝臟損傷或慢性肝病中，肝再生主要是肝祖細胞激活通過導管反應，增殖分化重新填充肝臟[16-19]。那么在急性肝損如肝部分切除術后，肝臟類器官是否能發(fā)揮類似肝祖細胞的促進肝再生作用，尚無相關的報道。單純的肝干細胞移植面臨植入效率低，植入后細胞存活時間短、植入后無法保證固定在理想位置等問題[20-21]。有研究表明，3D立體結構有利于細胞的增殖、分化[22]，這也是我們選擇肝臟類器官作為切入點的另一個原因。

首先我們對體外構建的肝臟類器官進行初步的鑒定。鏡下對肝臟類器官形態(tài)進行初步的觀察，發(fā)現(xiàn)經過3天的誘導培養(yǎng)，肝臟類器官從囊性結構轉變成球狀團塊，直徑擴增了近5倍，說明其具有快速增殖擴增的能力，與既往研究基本吻合[23]。進一步將傳代前后的類器官與肝組織進行基因表型鑒定，發(fā)現(xiàn)類器官顯示代表肝臟干細胞屬性的基因明顯上調，且在傳代前后均基因未見明顯差異[24-25]。免疫熒光顯示，肝臟上皮細胞標記物CK8、Desmin、AFP、PCNA為陽性，以上結論說明我們體外構建的肝臟類器官具有肝臟干細胞、上皮細胞屬性、具有增殖能力、基因能穩(wěn)定遺傳。

其次進行70%肝切除再生小鼠模型構建。肝臟再生整個周期大約是7 d。此前主要觀察時間點集中在第1、2、7天。在沒有外界干預的條件下，肝細胞增殖將在術后第2天將達到一個峰值[26]。經過前期預實驗的摸索，我們發(fā)現(xiàn)，治療組增殖在第4天達到峰值，因此本實驗觀察的時間點選在70%肝切除術后第1、4、7天。HE顯示，在術后第1天時，兩組均呈現(xiàn)一個典型的肝細胞損傷表現(xiàn)，出現(xiàn)大量的脂肪空泡，細胞基本結構消失。同時出現(xiàn)治療組較對照組損傷嚴重的現(xiàn)象，初步判斷可能是外源性移植導致的短暫的免疫排斥，加重損傷現(xiàn)象。而在第4天的時候，治療組小鼠肝細胞基本結構率先恢復正常，形態(tài)較清晰，無炎癥細胞浸潤，無脂肪或氣球樣變。免疫組化和Western blotting顯示，治療組在術后第1天增殖減弱，術后第4天增殖達到峰值，是對照組的近3倍，整體趨勢與HE顯示的損傷恢復相同。

最后通過血清肝功能指標來進行進一步的驗證。本研究發(fā)現(xiàn)，治療組在術后第4天ALT、AST、TBIL和DBIL明顯下降，ALB合成明顯增加，說明治療組肝臟整體的損傷恢復情況較對照組好。綜上所述，具有肝臟干細胞屬性和增殖能力的肝臟類器官，能通過保護肝細胞、改善部分肝切除術后小鼠肝功能，進而發(fā)揮促進肝再生作用，但是否通過類似肝祖細胞的導管反應還需要進一步論證。