朱長龍，王曉瓊，何常

(1.貴州醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院，貴州 貴陽 550025； 2.貴陽護理職業(yè)學院 基礎(chǔ)醫(yī)學部，貴州 貴陽 550081)

結(jié)直腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在發(fā)達國家中的 發(fā)病率明顯高于發(fā)展中國家，這可能與發(fā)達國家較高的肥胖率及飲食習慣等因素有關(guān)[1]。結(jié)直腸癌的病因和發(fā)病機制目前尚不完全清楚，近年來研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌的發(fā)生與許多腫瘤抑制基因失活、或原癌基因活化密切相關(guān)，提示結(jié)直腸癌發(fā)生過程中經(jīng)過了一系列較為復雜的分子事件。研究表明，缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)、細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導劑(CD147)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase ，MMP)均與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和不良預后密切有關(guān)[2]，本研究應用免疫組織化學技術(shù)標記結(jié)直腸癌組織中HIF-1α、CD147和MMP-9蛋白表達，分析這些指標與各種臨床病理參數(shù)的關(guān)系，初步探討這些指標對評估結(jié)直腸癌生物學行為的潛在關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本 收集病理科2012年1-6月80例結(jié)直腸癌手術(shù)患者的臨床資料，隨機選取其中37例未經(jīng)新輔助化療的結(jié)直腸腺癌作為實驗組，記錄患者的性別、年齡，收集腫瘤的病理分級、大小、部位、浸潤深度、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等臨床病理參數(shù)，同時選擇這37例患者結(jié)直腸癌切除組織旁的正常(癌旁)組織作為對照組。

1.1.2主要試劑 Anti-HIF-1α抗體(Santa Cruz，sc-13515,單克隆抗體)、Anti- CD147抗體(Santa Cruz，sc-21746,單克隆抗體)、Anti-MMP-9抗體(Santa Cruz，sc-21733,單克隆抗體)和免疫組化二抗EnvsionTM由上?；蛴邢薰咎峁?。

1.1.3納入和排除標準 納入標準按照2003版WHO結(jié)直腸癌病理診斷和分級標準：(1)有完整的性別、年齡、病理分級、腫瘤部位、浸潤深度、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TMN分期資料，(2)入組患者經(jīng)過首次病理確診行腫瘤根治術(shù)治療、未進行術(shù)前新輔助化療[3]。排除標準：(1)雙盲法復診時病理診斷和病理分級不一致的樣本，(2)患者資料不完整的樣本，(3)術(shù)前進行新輔助化療，導致病理組織學形態(tài)發(fā)生改變者[4]。

1.2 方法

按照EnvsionTM步驟處理組織標本，切取的組織標本石蠟包埋切片厚3 μm，60 ℃烤箱烘烤90 min；浸入兩缸二甲苯中、每缸中脫蠟10 min，再逐級放入100%無水酒精、90%酒精、70%酒精、純水各浸泡 5 min，3%過氧化氫孵育10 min，PBS溶液沖洗3次、每次3 min；浸泡在0.01 mmoL/L的EDTA(pH9.0)抗原修復液中，高溫高壓修復3 min；修復后室溫下靜置冷卻30 min，PBS溶液反復沖洗3次(3min/次)，滴加山羊血清封閉20 min、滴加一抗，4oC冰箱中孵育過夜、孵育過夜的切片在室溫中復溫40 min；PBS沖洗3次(3min/次)，滴加二抗，37 ℃水浴箱孵育1 h、二抗孵育完成后PBS沖洗3次(3min/次)，DAB顯色5 min后鏡下觀察顯色情況、PBS沖洗3次3 min滴加蘇木素染色1 min，自來水沖洗 3 min、脫水、最后進入二甲苯透明5 min 3次；中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察，由2名病理醫(yī)師雙盲法判定結(jié)果。

1.3 觀察指標

實驗組和對照組各取37張切片，每張切片隨機選取5個200倍視野，實驗組觀察計數(shù)結(jié)直腸癌中500個結(jié)直腸癌細胞，對照組觀察計數(shù)500個結(jié)直腸正常腺體上皮細胞。觀察兩組切片中HIF-1α、CD147和MMP-9蛋白染色強度評分和陽性細胞百分率，染色強度分數(shù)定義為0、1、2、3，不著色為0、淺黃色為1、棕黃色為2、黃褐色為3；計數(shù)500個細胞中的陽性細胞數(shù)，計算陽性百分率，陽性百分率評分：1%～25%記為1分、26%～50%記為2分、51%～75%記為3分、>75%記為4分。強度和百分比的乘積作為免疫組化評分(IRS)，IRS評分<4分判讀為陰性表達、≥4分者為陽性表達[5]。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析，率的比較采用χ2檢驗，2組間比較以P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義，采用Pearson法對HIF-1α、CD147和MMP-9蛋白陽性表達進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α、CD147及MMP-9蛋白表達

結(jié)果顯示，實驗組HIF-1α、CD147及MMP-9蛋白表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1和表1。

圖1 兩組組織標本中HIF-1α、CD147和MMP-9表達(Envison，×200)Fig.1 The expression of HIF-1α, CD147and MMP-9 in two groups of tissue samples(Envison，×200)

表1 兩組組織標本中HIF-1α、CD147和MMP-9表達[n(%)]Tab.1 The expression of HIF-1α, CD147and MMP-9 in two groups of tissue samples[n(%)]

2.2 HIF-1α、CD147及MMP-9蛋白表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

腫瘤組織中HIF-1α、CD147及MMP-9蛋白表達與患者性別、年齡、腫瘤部位、病理分級、浸潤深度、神經(jīng)侵犯、脈管受累、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；HIF-1α及CD147蛋白表達與腫瘤大小有關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；HIF-1α、CD147及MMP-9蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 HIF-1α、CD147及MMP-9表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]Tab.2 Correlation between the expression of HIF-1α, CD147and MMP-9 and clinicopathological features of colorectal cancer patients[n(%)]

2.3 結(jié)直腸癌中 HIF-1α、CD147及MMP-9蛋白表達的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌腫瘤組織中HIF-1α、MMP-9及CD147蛋白表達間互相呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 結(jié)直腸癌患者HIF-1α、CD147和MMP-9表達的相關(guān)性Tab.3 The correlation between expression of HIF-1α, CD147 and MMP-9 in colorectal cancer patients

注：(1)P<0.05。

3 討論

結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，在中國乃至全球均有非常高的發(fā)病率和致死率。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌發(fā)病與低纖維、高脂肪飲食，肥胖率增加等風險因素有密切關(guān)系[6]。隨著對結(jié)直腸癌研究不斷深入，認為結(jié)直腸癌可能是在各種致腫瘤因素共同作用下，逐漸經(jīng)過一系列如原癌基因活化，腫瘤抑制基因突變，腫瘤抑制基因缺失，啟動子甲基化和或乙?；馗淖兊确肿邮录橛胁±斫M織形態(tài)學改變及惡性腫瘤生物學行為后，最終導致結(jié)直腸癌的發(fā)生。

HIF在人類編碼6種蛋白，其中HIF-1α是目前關(guān)注的熱點。越來越多的證據(jù)表明，隨著腫瘤生長速度增快，導致供血不足，形成局部缺氧，是腫瘤環(huán)境中最常見的一種情況[7]。在缺氧環(huán)境中，HIF-1α易活化，HIF-1α活化后促進血管內(nèi)皮生長因子VEGF、hgf和met原癌基因的表達，并參與糖代謝，紅細胞生成，血管形成。同時參與細胞存活、凋亡以及對腫瘤藥物抗藥性形成等重要生物學功能中，從而維持組織、細胞在缺氧條件下內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，以適應缺氧[8]。在人類多種實體腫瘤中都可檢測到HIF-1α高表達。應用免疫組織化學技術(shù)檢測134例鋸齒狀息肉、104例非鋸齒狀腺瘤、81例囊性腺瘤和74例鋸齒狀結(jié)直腸癌檢測HIF-1α和VEGF，發(fā)現(xiàn)鋸齒狀息肉和鋸齒狀結(jié)直腸癌普遍存在HIF-1α表達增高，提示HIF-1α對在腫瘤發(fā)生和進展起著重要作用[9]。本組研究結(jié)果顯示，37例結(jié)直腸癌組織中，HIF-1α蛋白陽性率為70.3%(26/37),正常對照組織中為13.5%(5/37)，HIF-1α蛋白在結(jié)直腸癌腫瘤組織中明顯高于正常組織(P<0.05)，同時在實體腫瘤中腫瘤直徑大者(P<0.05)和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)明顯出現(xiàn)HIF-1α蛋白高表達。綜合以往的研究結(jié)果，本研究認為在正常結(jié)直腸組織和結(jié)直腸癌早期以及腫瘤體積較小時候，由于有足夠的血液供應，細胞微環(huán)境為非缺氧狀態(tài)，HIF-1α蛋白被降解。但是隨著腫瘤組織不斷生長，腫瘤細胞微環(huán)境逐漸轉(zhuǎn)變由有氧環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)槿毖醐h(huán)境，腫瘤細胞中HIF-1基因活化增強并伴有HIF-1蛋白降解減弱。HIF-1α蛋白促進了腫瘤細胞增殖和血管形成，并促進了腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[10-11]。但HIF-1蛋白與腫瘤演進的分子機制有待進一步研究證實。

CD147基因定位于19p13.3號染色體，CD147是一種54kDa糖基化跨膜蛋白，CD147通過刺激基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和細胞因子的分泌，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡和腫瘤細胞遷移、轉(zhuǎn)移和分化及腫瘤耐藥性的形成等重要功能[12]。CD147是促進腫瘤侵襲、生長、進展和轉(zhuǎn)移的核心。大量研究證實CD147的過度表達與腫瘤進展、轉(zhuǎn)移發(fā)展和耐藥性等現(xiàn)象之間的相關(guān)性[4]。此外在一組入組328例結(jié)直腸癌患者的研究應用免疫組織化學方法檢測結(jié)直腸癌組織中CD147的表達，采用統(tǒng)計學分析評價CD147表達與結(jié)直腸癌患者無疾病生存率的關(guān)系，結(jié)果顯示CD147在結(jié)直腸癌中表達增加(P<0.001)，與腫瘤侵襲(P<0.001)、轉(zhuǎn)移(P<0.001)和TNM分期(P<0.001)有關(guān)，這些結(jié)果提示CD147在人類結(jié)直腸癌復發(fā)中的潛在作用，這可能是預測結(jié)直腸癌復發(fā)的一種新的分子標記物[13]。本研究通過對本組37例的結(jié)直腸癌組織中CD147檢測發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中CD147表達明顯高于正常組織，同時結(jié)直腸癌組織中CD147的高表達與腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，本研究結(jié)果與既往研究相似，表明CD147在結(jié)直腸癌組織中是一個非常關(guān)鍵的因子，可能參與腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移[14]。在本組病例中未觀察到CD147與腫瘤侵襲性指標，如神經(jīng)侵犯，脈管侵犯等，以及腫瘤TNM分期的相關(guān)性，可能與入組病例數(shù)較少有關(guān)。

MMPS是鋅依賴性內(nèi)肽酶家族，由25個成員組成，MMP家族成員MMP-9起著關(guān)鍵的蛋白酶作用，MMP-9蛋白一旦被激活，MMP-9蛋白就能夠降解許多細胞外基質(zhì)[15]。Jeroen等[16-17]通過免疫組織化學染色檢測507例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)MMP-9過度表達與腫瘤細胞過度增殖、細胞凋亡、血管生成及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。并發(fā)現(xiàn)在原發(fā)結(jié)直腸癌和未接受系統(tǒng)治療的腫瘤組織中MMP-9蛋白的高表達，具有評估預后的價值，是早期檢測結(jié)直腸癌復發(fā)、轉(zhuǎn)移和預后的生物標志物[18]。本研究結(jié)果顯示，37例結(jié)直腸癌組織中，MMP-9蛋白在結(jié)直腸癌腫瘤組織中陽性率為54.1%(20/37)，在正常對照組中為16.2%(6/37)，MMP-9蛋白在腫瘤組織表達明顯高于正常組織，MMP-9蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示高水平的MMP-9蛋白促進細胞周圍基質(zhì)降解，有助于腫瘤細胞突破細胞外基質(zhì)的屏障作用，向周圍的脈管發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移，可見MMP-9蛋白在介導腫瘤細胞惡性生物學行為過程中起到重要的作用[19]。

HIF-1α通過誘導數(shù)百個基因的轉(zhuǎn)錄，在腫瘤的生長和惡性進展中發(fā)揮重要作用，這些基因在提高腫瘤組織中的氧利用率并誘導血管生成、使腫瘤細胞擺脫缺氧并促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，以及癌細胞對缺氧微環(huán)境的適應(代謝重編程)[6]。CD147表達上調(diào)后能促進腫瘤生長，抑制腫瘤細胞凋亡，增強其缺氧侵襲能力[20]。CD147刺激對MMP降解細胞外基質(zhì)并導致腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要意義[15]。本研究結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌腫瘤組織中，HIF-1α、MMP-9、CD147蛋白表達之間互相呈正相關(guān)(P<0.05)。

綜上所述，綜合已有國內(nèi)外研究結(jié)果結(jié)合本研究結(jié)果，本研究認為HIF-1α、CD147、MMP-9蛋白表達與結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展是有著密切的關(guān)系，即HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄活化，癌細胞對缺氧微環(huán)境的適應，同時提高腫瘤組織中的氧利用率、誘導血管生成、腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強；同時HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄活性增強后，對CD147啟動子激活的介導作用加強，CD147刺激對MMP-9降解細胞外基質(zhì)，從而促進腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移以及耐藥性產(chǎn)生[21]。但HIF-1α、CD147和 MMP-9 3種分子在信號傳導通路上相互作用和相互關(guān)系的分子機制，有待進一步深入研究。