方宗宇，馬莉，張智琪，吳青青**

(1.貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學附院 檢驗中心，貴州 貴陽 550004)

BCR-ABL融合突變是由于染色體易位t(9;22)(q34;q11.2)導致費城染色體(philadelphia chromosome,Ph)的形成而產(chǎn)生, 是慢性髓系白血病的典型特征[1-2]，研究發(fā)現(xiàn)，20%～30%的成人急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)和 3%～5%的兒童ALL中可檢測到Ph染色體[3-7]。BCR-ABL融合突變導致酪氨酸激酶持續(xù)激活, 進而激活多種信號通路, 促進細胞增殖、抑制細胞分化和黏附等[8]。BCR-ABL由于含有持續(xù)的酪氨酸激酶活性, 因此含有BCR-ABL融合基因的患者對酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors,TKIs) 敏感[9]。甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate，IM)是TKI的典型代表，作為BCR/ABL融合基因的靶向治療藥物，IM在Ph+ALL的治療中作為首選藥物可提高緩解率，但復發(fā)率高，易產(chǎn)生耐藥，并且對總生存率和長期無病生存率無明顯提高[10]。Ph+ALL對TKI耐藥機制復雜，報道較多的機理有耐藥相關基因如MDR和MRP等的高表達[11]、基因點突變[12]、BCR/ABL基因擴增[13]以及多條信號通路激活等[12]，是目前國內(nèi)外研究的熱點，但其具體機制仍未完全明確。因Ph+ALL中以Ph+B-ALL為主，本研究以Ph+B-ALL細胞系(SUP-B15)為對象，建立IM耐藥的Ph+B-ALL細胞系(SUP-B15/IM)，為尋找參與Ph+B-ALL的IM 耐藥的基因提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑

親本細胞(SUP-B15)和IMDM培養(yǎng)基購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，伊馬替尼(sigma，美國)、胎牛血清(BI，以色列)、青鏈霉素(Hyclone，美國)、臺盼藍(Solarbio，北京)、PBS(Hyclone，美國)、培養(yǎng)瓶和離心管(Corning，美國)、Cell Counting Kit-8(同仁公司，日本)、AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒(BD，美國)、RNA提取試劑Trizol(Invitrogen，英國)，逆轉錄試劑盒和TB GreenTMPremix Ex TaqTMII試劑盒均購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1IM誘導SUP-B15/IM細胞系模型的建立 SUP-B15細胞在含有20%胎牛血清，含100 U/mL的青霉素和100 mg/L的鏈霉素的IMDM 培養(yǎng)基、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)Boichuk等[14]研究，用小劑量濃度遞增間歇誘導的方式加入IM誘導細胞耐藥，由于初期加入藥物細胞極易死亡，因此第一次加藥濃度極低，為0.2 μmol/L[約為SUP-B15親本細胞1/80半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)值]。首先配置好完全培養(yǎng)基，加入一定量1 mmol/L IM儲備液配置成0.2 μmol/L工作液，再加入到細胞沉淀中，用吸管輕柔吹吸混勻后轉移到T25培養(yǎng)瓶后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，待細胞生長穩(wěn)定后再進行下一個藥物濃度的誘導。誘導初期藥物濃度每次增加0.2 μmol/L，達到1 μmol/L濃度后、每次增加0.5 μmol/L，達到5 μmol/L濃度后、每次增加1 μmol/L，直到獲得了能在10 μmol/L IM條件下持續(xù)傳代的耐藥細胞SUP-B15/IM；對照組細胞SUP-B15/C除了不加藥物外，其傳代方法及次數(shù)同耐藥組。在驗證實驗使用之前，將SUP-B15/IM細胞維持在不含IM的培養(yǎng)基中，并傳代至少3次。

1.2.2細胞形態(tài)學觀察 取對數(shù)生長期的親本細胞(SUP-B15)、對照組細胞(SUP-B15/C)和耐藥組細胞(SUP-B15/IM)于倒置顯微鏡(100×)下觀察細胞形態(tài)。

1.2.3細胞短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat，STR)鑒定 耐藥成功后，分別收集106個SUP-B15/C和SUP-B15/IM細胞，送至蘇州金唯智生物科技有限公司行STR鑒定。利用軟件對數(shù)據(jù)進行分析，并與相應的數(shù)據(jù)庫進行比較。

1.2.4細胞毒實驗及IC50測定 采用CCK8法分別檢測親本細胞(SUP-B15)、對照組細胞(SUP-B15/C)和耐藥組細胞(SUP-B15 /IM)對IM的敏感性。取各組對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板中，每孔細胞濃度為5×105個。實驗孔加入不同濃度的IM(20、40、60、80、100、120、140和160 μmol/L)，每個濃度設8個復孔；另外再設置不含IM的對照孔和不含細胞的空白孔，對照孔和實驗孔分別加入與IM相同體積的注射用生理鹽水，置于37 ℃ 5%CO2孵箱中孵育24 h后，在每孔中加入10 μL CCK8試劑，再置于孵箱中孵育4 h，用酶標儀測定450 nm處的吸光度值。8個復孔的數(shù)值去掉一個最高值和一個最低值，其余6孔吸光度值的平均值按下列公式計算抑制率，繪制生長曲線。抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%，其中Ac，As，Ab分別為對照孔、實驗孔及空白孔在450 nm波長處的吸光度值。用GraphPad Prism 5 軟件計算細胞IC50值，再根據(jù)IC50值計算出耐藥指數(shù)(resistance index，RI)。RI=耐藥細胞系的 IC50/對照細胞系的 IC50。

1.2.5細胞凋亡分析 用不同濃度(0、10和100 μmol/L)的IM處理細胞24 h后，使用AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒檢測細胞存活和凋亡。分別收集SUP-B15/C和SUP-B15/IM細胞約5×105個，加入Binding Buffer 50 μL，再加入Annexin V-FITC 5 μL和Propidium lodide 5 μL混勻，室溫下避光孵育15 min；最后加入Binding Buffer 200 μL重懸上流式細胞儀檢測，并分析凋亡率。

1.2.6相關耐藥基因MDR1和MRP5 用不同濃度(0和100 μmol/L)的IM處理細胞24 h后分別收集106個對數(shù)生長期的SUP-B15/C和SUP-B15/IM細胞，按照RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒操作說明提取總RNA，逆轉錄為cDNA，并去除組織DNA；取cDNA 300 ng，使用RT-PCR法擴增MDR1和MRP5 mRNA。反應條件：95 ℃預變性30 s，然后95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)，最后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min。內(nèi)參基因β-actin上游引物5′-TGGCACCCAGCACA ATGAA-3′，下游引物5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′；MDR1上游引物5′-GAGAGATCCTCACCAAGCGG-3′，下游引物5′-CGAGCCTGGTAGTCAATGCT-3′；MRP5上游引物5′-GTCCTGGGTATAGAAGTGTG-3′，下游引物5′-CAGAAGATCCACACAACCCT-3′。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 細胞形態(tài)特征

采用光學顯微鏡觀察SUP-B15、SUP-B15/C和SUP-B15/IM細胞，結果顯示SUP-B15細胞為懸浮細胞、圓形、大小排列均勻、邊界清晰可見，具有典型淋巴細胞的特征(圖1A)；SUP-B15/C細胞在傳代過程中仍然保持典型淋巴細胞的特征(圖1B)，而耐藥的SUP-B15/IM細胞呈懸浮生長、細胞體積變小、邊界不清(圖1C)。

SUP-B15細胞 SUP-B15/C細胞 SUP-B15/IM細胞圖1 細胞形態(tài)比較(100×)Fig.1 Comparison of cellular morphology (100×)

2.2 SUP-B15 /C和SUP-B15 /IM細胞STR鑒定

STR鑒定結果顯示，經(jīng)過與數(shù)據(jù)庫進行比較，兩株細胞均與SUP-B15細胞遺傳位點吻合(圖2)。

注：C為SUP-B15/C細胞，R為SUP-B15/IM細胞。圖2 培養(yǎng)細胞的STR鑒定Fig.2 STR identification of cultured cells

2.3 3組細胞的IC50

通過CCK8法檢測SUP-B15、SUP-B15/C和SUP-B15/IM細胞對IM 的IC50，結果顯示：SUP-B15細胞對IM的IC50是16.72 μmol/L，SUP-B15/C細胞對IM的IC50是22.53 μmol/L，SUP-B15/IM細胞對IM的IC50是277.2 μmol/L，其中SUP-B15細胞與SUP-B15/C細胞的IC50比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；SUP-B15/IM細胞對SUP-B15/C細胞的RI為12.3。見圖3。

圖3 不同濃度IM作用后SUP-B15、SUP-B15/C和SUP-B15/IM細胞的存活率Fig.3 Survival rate of SUP-B15, SUP-B15/C and SUP-B15/IM cells after IM different concentrations

2.4 SUP-B15 /C和SUP-B15 /IM細胞凋亡分析

流式細胞術檢測結果顯示，在IM濃度為0和10 μmol/L時SUP-B15/C細胞與SUP-B15/IM細胞的凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而在IM濃度100 μmol/L時SUP-B15/C細胞的凋亡率明顯高于SUP-B15/IM細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖4)。

注：A為SUP-B15/C細胞凋亡流式圖；B為 SUP-B15/IM細胞凋亡流式圖(10、100為加10和100 μmol/L IM)；C為凋亡率分析；(1)與SUP-B15/IM細胞比較，P<0.001。圖4 不同濃度IM下SUP-B15/C及SUP-B15/IM細胞凋亡Fig.4 SUP-B15/C and SUP-B15/IM apoptosis at different concentrations of IM

2.5 SUP-B15/C和SUP-B15/IM細胞中MDR1和MRP5的mRNA表達

100 μmol/L IM濃度下，SUP-B15/IM細胞中MDR1和MRP5 mRNA表達水平顯著高于SUP-B15/C細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖5)。

注：(1)與SUP-B15/C細胞比較，P<0.001。圖5 SUP-B15 /IM與SUP-B15/C細胞MDR1和MRP5 mRNA表達Fig.5 Expression of MDR1 and MRP5 mRNA in SUP-B15/IM and SUP-B15/C cells

3 討論

開發(fā)建立耐藥腫瘤細胞模型對于人類進行相關基礎研究和藥物的評價進而攻克腫瘤治療具有重大意義[14]。而在眾多建立耐藥模型的方法里，藥物濃度遞增法是最常用且有效的方法，所建立的耐藥細胞系具有耐藥性穩(wěn)定、可靠的特點，耐藥倍數(shù)普遍高于其他方式建立的耐藥細胞株[15]。另外目前尚缺乏Ph+B-ALL耐藥模型，建立穩(wěn)定有效的耐藥細胞株對Ph+B-ALL的研究尤為重要；因此，本研究采用藥物濃度遞增法建立的Ph+B-ALL耐藥細胞株可以為研究更深的耐藥機制提供模型，為攻克Ph+B-ALL臨床耐藥治療打下基石。

在本研究中，從Ph+B-ALL細胞系(SUP-B15)建立了對IM產(chǎn)生耐藥性的耐藥細胞系(SUP-B15/IM)。在誘導前期，細胞對IM極度敏感，因此起始階段加入的IM濃度極低，且增加IM濃度緩慢；在誘導3個月后，細胞生長速度有所增加，因此增加藥物濃度梯度變大，這可能是由于細胞已經(jīng)產(chǎn)生了一定的耐藥性。值得注意的是，在誘導過程中，細胞形態(tài)發(fā)生了一些改變，例如細胞體積縮小，形態(tài)變得不規(guī)則，散在生長。

據(jù)統(tǒng)計約30%細胞系被交叉污染或錯誤辨識，在細胞的傳代過程 導致研究結果出現(xiàn)偏移[16-17]。STR鑒定可以證實本研究的細胞是否被污染或錯誤辨識。本研究的細胞經(jīng)STR鑒定，表明通過12個月的誘導耐藥，細胞的短串聯(lián)重復序列沒有發(fā)生變化，說明細胞未出現(xiàn)問題。另外CCK8實驗表明，SUP-B15/IM細胞對SUP-B15/C細胞的耐藥指數(shù)為12.3，而SUP-B15細胞與SUP-B15/C細胞的IC50無明顯差異，說明耐藥組細胞確實產(chǎn)生了耐藥性。凋亡實驗也表明，濃度為100 μmol/L IM作用細胞24 h后，SUP-B15/IM細胞的凋亡率遠低于SUP-B15/C細胞，同樣說明耐藥誘導成功。

MDR1是耐藥相關基因，它編碼P-糖蛋白(Pgp)，Pgp嵌于細胞膜表面形成具有外排功能的“泵”，能逆向轉運藥物排出細胞外，防止毒物在胞內(nèi)積聚對細胞造成損害[18]。有研究表明，MDR1基因的過度表達導致Pgp活性增加，從而降低IM對細胞的殺傷性[19-20]，另外研究證明，MRP5能夠轉運cGMP，也能將藥物排出胞外[21]。RT-PCR結果表明，在SUP-B15/IM細胞中用100 μmol/L IM作用細胞后MDR1和MRP5 mRNA表達水平顯著高于SUP-B15/C，意味著這兩個基因參與了SUP-B15/IM的耐藥過程。

總之，本研究建立了對IM具有高耐藥性的SUP-B15/IM系，為Ph+B-ALL患者耐藥機制研究提供了細胞模型。