謝鵬, 任真奎, 呂菊, 胡玉梅, 吳昌學(xué)*, 禹文峰*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004； 3.黔西南州人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，貴州 興義 562400)

腦卒中是世界上排名第二的死亡原因，嚴(yán)重威脅人類生命健康[1]。腦血管破裂或阻塞引起的大腦缺血再灌注損傷是導(dǎo)致腦卒中的主要原因，缺血再灌注損傷是卒中大腦損傷的一個(gè)不可逆性事件。研究表明，缺血再灌注導(dǎo)致的細(xì)胞線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、能量耗竭、氨基酸興奮性中毒、神經(jīng)炎癥和鈣離子負(fù)荷超載等過程都參與了缺血再灌注損傷[2-4]，提示缺血再灌注損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理過程。因此，明確缺血再灌注損傷的分子機(jī)理對(duì)認(rèn)識(shí)腦卒中的發(fā)病機(jī)制及治療具有重要意義。自噬體是指細(xì)胞內(nèi)部形成一個(gè)包裹胞質(zhì)成分或衰老細(xì)胞器的雙層膜泡[5]，自噬體外膜與溶酶體膜融合，形成自噬溶酶體，利用溶酶體內(nèi)的水解酶降解被包裹的成分，并將降解的小分子物質(zhì)合成新的細(xì)胞成分。正常生理狀態(tài)下，自噬過程會(huì)維持在本底水平以維持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，但在應(yīng)激、饑餓等刺激條件下可被誘導(dǎo)至較高的水平[6-7]。細(xì)胞內(nèi)自噬水平的異常調(diào)控會(huì)導(dǎo)致如癌癥、肌肉疾病、代謝疾病、感染和神經(jīng)退行性疾病等一系列疾病的發(fā)生[8-9]；自噬是一個(gè)具有雙重作用的生理過程，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有積極作用，但異常的細(xì)胞自噬調(diào)控過程會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)“自噬性的死亡”[10-11]。近年的研究顯示，組織缺血缺氧會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生自噬反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體自身的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，當(dāng)自噬功能障礙時(shí)又會(huì)反過來協(xié)同加劇細(xì)胞組織壞死[12-14]。目前自噬在缺血再灌注損傷中的作用尚不清楚，因此，本研究通過對(duì)氧糖剝奪/復(fù)氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)體外構(gòu)建的缺血再灌注高分化大鼠嗜鉻神經(jīng)瘤細(xì)胞(PC12)模型來探討自噬在缺血再灌注損傷中的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

PC12細(xì)胞系購買自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，DMEM培養(yǎng)基(賽默飛世爾科技有限公司)、胎牛血清(美國(guó)Gibco 公司)、DMEM無糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco 公司)、磷酸鹽緩沖溶液(以色列Biological Industries)、蛋白酶抑制劑(CST)、0.25%胰酶消化液(美國(guó)Gibco公司)、雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貝博生物)和ROS檢測(cè)試劑盒(貝博生物)、ECL-Plus發(fā)光液(賽默飛世爾科技有限公司)、PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)，微管相關(guān)蛋白輕鏈-1A/1B (microtubule-associated protein 1A/1B-light, LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ)、泛素結(jié)合蛋白(P62)、自噬相關(guān)基因BECN1(Beclin-1)和凋亡分子裂解型胱天蛋白水解酶3 (Cleaved-caspase3)抗體購買自美國(guó)CST。

1.2 方法

1.2.1PC12細(xì)胞培養(yǎng)及缺血再灌注模型建立 1%雙抗+10%FBS+89%DMEM培養(yǎng)基配方傳代培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞按2×105/孔密度接種至六孔板內(nèi)，細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%時(shí)進(jìn)行缺血再灌注模型建立。對(duì)合適密度的細(xì)胞吸棄原培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗細(xì)胞兩遍后加2 mL無糖培養(yǎng)基(不含血清)，置于三氣培養(yǎng)箱[37 ℃，1%氧氣(O2)+94%氮?dú)?N2)+5%二氧化碳(CO2)]進(jìn)行OGD處理，OGD 4 h后棄原培養(yǎng)基，PBS洗細(xì)胞兩遍，加高糖培養(yǎng)基2 mL(不含血清),置于正常培養(yǎng)箱(37 ℃，5%CO2)行復(fù)氧糖處理以模擬再灌注(reoxygenation)，后于不同時(shí)間段(0、6、12、18和24 h)進(jìn)行后續(xù)干預(yù)處理。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)處理 實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(Control)、缺氧4 h組(OGD4)、缺氧4 h復(fù)氧(OGD4/R)不同時(shí)間段組(OGD4+R6、OGD4+R12、OGD4+R18、OGD4+R24)、自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)預(yù)處理再缺氧/復(fù)氧組(OGD/R+3-MA)。Control組細(xì)胞在含正常糖培養(yǎng)基置于正常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)作為對(duì)照；OGD4/R組細(xì)胞按上述方法進(jìn)行培養(yǎng)處理；OGD/R+3-MA組細(xì)胞先進(jìn)行3-MA(2.5 mmol/L)預(yù)處理2 h后再行OGD4/R24處理作為藥物干預(yù)處理組。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 分組干預(yù)處理后的細(xì)胞按照說明書操作步驟進(jìn)行流式分析檢測(cè)細(xì)胞的凋亡水平變化。不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞后離心收集，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，去除PBS后用結(jié)合液400 μL懸浮細(xì)胞，在懸液中加入Annexin V-FITC染色液5μL，輕輕混勻后避光孵育15 min，再加入PI染色液10 μL輕輕混勻避光孵育5 min，上機(jī)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率變化，結(jié)果以百分比表示。

1.2.4DCFH-DA熒光探針法檢測(cè)細(xì)胞活性氧(ROS) 收集干預(yù)處理后的細(xì)胞樣本按照操作說明書步驟進(jìn)行，用不含血清的培養(yǎng)基按照1 ∶1 000的比例稀釋活性氧檢測(cè)探針，離心收集后的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞，離心后用按比例稀釋的探針1 mL重懸細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞45 min，其間輕輕顛倒混勻4次，孵育結(jié)束后用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，1 000 r/min離心收集細(xì)胞，最后用培養(yǎng)基0.5 mL懸浮細(xì)胞進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)分析，平均熒光強(qiáng)度表示ROS含量，結(jié)果以相對(duì)Control組的倍數(shù)表示。

1.2.5細(xì)胞自噬(P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)和凋亡(Cleaved-caspase3)相關(guān)分子檢測(cè) 采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)自噬標(biāo)志分子LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62、自噬相關(guān)基因Beclin-1和凋亡分子Cleaved-caspase3的表達(dá)變化。細(xì)胞經(jīng)過干預(yù)處理后，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗細(xì)胞兩遍，盡量吸棄PBS后按每孔120 μL的量加裂解液(RIPA)，置于冰上裂解細(xì)胞5 min后用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞至1.5 mL干凈的離心管中，于冰上繼續(xù)裂解20 min后，12 000 r/min離心收集上清至新的干凈1.5 mL離心管中。采用BCA蛋白定量試劑盒定量分析蛋白濃度，5×SDS buffer，100 ℃，5～10 min變性蛋白后按每孔30 μg等量上樣30 mA恒流電泳分離蛋白，220 mA恒流轉(zhuǎn)膜120 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后5%脫脂奶粉室溫封閉膜1.5 h，PBST洗膜5 min后孵育一抗，4 ℃搖床過夜；次日，每10 min 1×TBST洗膜3次,室溫孵育二抗2 h,每10 min TBST洗膜3次，ECL-Plus發(fā)光液于GeneGnome XRQ曝光，GAPDH作為內(nèi)參，ImageJ軟件進(jìn)行蛋白定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 OGD4 h后復(fù)氧不同時(shí)間PC12細(xì)胞凋亡的影響

與Control組比較，OGD4+R6、OGD4+R12、OGD4+R18和OGD4+R24組誘導(dǎo)了PC12細(xì)胞凋亡率明顯升高，細(xì)胞凋亡率伴隨復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其中OGD4+R24組細(xì)胞凋亡率最高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為細(xì)胞流式圖；B為凋亡率柱狀圖；(1)與control組比較P<0.05。圖1 OGD4 h后復(fù)氧不同時(shí)間對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effects of apoptosis of PC12 cells on the different time of reoxygenation after OGD 4 h

2.2 OGD4 h后不同復(fù)氧時(shí)間對(duì)PC12細(xì)胞ROS的影響

與Control組比較，OGD4、OGD4+R6和OGD4+R12、OGD4+R18和OGD4+R24組誘導(dǎo)ROS升高，細(xì)胞 ROS伴隨復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其中OGD4+R24組細(xì)胞ROS最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為ROS熒光強(qiáng)度，B為ROS相對(duì)表達(dá)倍數(shù)柱狀圖；(1)與control組比較,P<0.05。圖2 OGD4 h后復(fù)氧不同時(shí)間對(duì)PC12細(xì)胞ROS的影響Fig.2 Effects of ROS production of PC12 cells on the different time of reoxygenation after OGD 4 h

2.3 OGD4 h后復(fù)氧不同時(shí)間對(duì)P12細(xì)胞P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Cleaved-caspase3表達(dá)的影響

與Control組比較，OGD4 h后復(fù)氧不同時(shí)間段(R0、R6、R12、R18和R24 h)組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比率、P62、Beclin-1和C-caspase3的表達(dá)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。結(jié)果顯示，OGD4+R24組細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)分子水平上升最高，因此后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇OGD4+R24組作為藥物干預(yù)的模型組。

注：A為Western blot條帶圖，B為相對(duì)表達(dá)量柱狀圖； (1)與control組比較P<0.05。圖3 OGD4 h后復(fù)氧不同時(shí)間對(duì)PC12細(xì)胞P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和C-caspase3表達(dá)的影響Fig.3 Expression of P62,Beclin-1,LC3-Ⅰ,LC3-Ⅱ and C-caspase3 of PC12 cells on the different time of reoxygenation after OGD 4 h

2.4 3-MA減少對(duì)OGD/R處理后P12細(xì)胞P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Cleaved-caspase3表達(dá)的影響

與OGD4+R24組比較，OGD/R+3-MA組相關(guān)的自噬分子P62、Beclin-1的表達(dá)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比率以及凋亡分子C-caspase3的表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：A為Western blot條帶圖，B為相對(duì)表達(dá)量柱狀圖； (1)與OGD/R組比較，P<0.05。圖4 3-MA對(duì)OGD/R處理后PC12細(xì)胞P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和C-caspase3表達(dá)的影響Fig.4 Effects of 3-MA on OGD/R induced expression of P62,Beclin-1,LC3-Ⅰ,LC3-Ⅱ and C-caspase3

3 討論

腦卒中主要是由于大腦缺血和缺血后再灌注損傷所導(dǎo)致的疾病。目前，大腦缺血再灌注損傷的分子病理假說主要有以下幾個(gè)方面：(1)缺血導(dǎo)致的局部血流供應(yīng)中斷和能量耗竭使神經(jīng)元發(fā)生不可逆性的壞死[15]；(2)缺血后再灌注引發(fā)的興奮性氨基酸中毒反應(yīng)；(3)缺血和再灌注階段過量生成的自由基(ROS和NO)引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[16]；(4)缺血再灌注導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生神經(jīng)炎癥反應(yīng)[13]；(5)缺血再灌注導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能障礙，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡等幾個(gè)方面的假說[17]。缺血再灌注損傷復(fù)雜的分子機(jī)制為腦卒中的預(yù)防和治療帶來了困難[18-19]。因此，闡明缺血再灌注損傷的分子機(jī)制對(duì)腦卒中的預(yù)防及治療具有重要意義。

近年來有研究表明，自噬參與了諸如癌癥、代謝類疾病和神經(jīng)退行型性等疾病的病理過程[20-22]。但是對(duì)于其確切的分子機(jī)理認(rèn)識(shí)是不清楚的。研究報(bào)道，在缺血再灌注心肌的細(xì)胞模型上，觀察到了自噬水平的異常升高且加劇了心肌細(xì)胞的損傷，給予自噬相關(guān)的抑制劑可以有效緩解缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[23]。與此相反地，有研究表明，藥物或者非編碼RNA等在MCAO模型大鼠上可以激活神經(jīng)細(xì)胞自噬并發(fā)揮減緩缺血再灌注損傷的作用[24-25]。顯然，自噬在缺血再灌注損傷中的確切分子機(jī)制是不清楚的，有待更多的實(shí)驗(yàn)研究闡釋。

本研究PC12細(xì)胞運(yùn)用于經(jīng)典的OGD/R模型上，探討不同再灌注時(shí)間對(duì)細(xì)胞損傷和自噬的影響。研究發(fā)現(xiàn)，隨著缺血后再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的凋亡水平和ROS含量是不斷增加的，ROS是機(jī)體細(xì)胞代謝過程產(chǎn)生一類強(qiáng)氧化性物質(zhì)，機(jī)體本身具有清除活性氧的能力，但是過量生成的活性氧會(huì)導(dǎo)致機(jī)體抗氧化系統(tǒng)障礙，ROS氧化生物有機(jī)體細(xì)胞的細(xì)胞器導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，這樣的過程對(duì)神經(jīng)細(xì)胞而言是致命性的損傷。神經(jīng)細(xì)胞功能障礙是多種神經(jīng)退型性疾病的主要原因。在缺血后再灌注的不同時(shí)間段，本研究檢測(cè)到自噬的水平是不斷增加的，細(xì)胞的凋亡水平也是伴隨著升高的。自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1/GAPDH的比例增加，裂解型的Caspase3表達(dá)水平升高，有趣的是，在再灌注的剛開始6 h內(nèi)，自噬水平升高的同時(shí)凋亡水平并沒有顯著升高，但是隨著再灌注的時(shí)間延遲，凋亡的水平逐漸升高，并伴隨著功能障礙性的自噬出現(xiàn)。據(jù)此推測(cè)，在再灌注的早期階段，自噬對(duì)細(xì)胞發(fā)揮著積極地保護(hù)作用，但隨著后期再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，自噬功能障礙，自噬小體堆積進(jìn)而反過來加劇細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)自噬性的死亡，表現(xiàn)為自噬特異性降解的底物分子P62的表達(dá)增加。因此，再灌注的后期階段，本研究給予自噬特異性的抑制劑3-MA預(yù)處理，結(jié)果顯示，3-MA可以有效降低缺血再灌注誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞的自噬水平。

綜上所述，本次研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注的后期階段(18～24 h)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生自噬性的死亡，表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡水平升高，自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ翻轉(zhuǎn)的比率增加，自噬特異性降解底物P62表達(dá)堆積；特異性自噬抑制劑3-MA可以顯著降低缺血再灌注后期階段誘導(dǎo)的自噬水平并減少再灌注誘導(dǎo)的凋亡水平升高。