吳一民，李瑞峰，呂惠成，于寶龍，李文選，張沛

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 骨科，內(nèi)蒙古 呼和浩特)

0 引言

嗅鞘細(xì)胞可以通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子來改善了脊髓損傷后的微環(huán)境，營養(yǎng)和支持神經(jīng)元細(xì)胞，在神經(jīng)元細(xì)胞的再生修復(fù)中具有誘導(dǎo)分化以及促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞增殖和再生等作用。本研究建立嗅鞘細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞的非接觸共培養(yǎng)體系，研究嗅鞘細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞生長、增殖的潛能與條件，找到介導(dǎo)神經(jīng)營養(yǎng)因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體通路，為脊髓損傷的治療提供新的理論基礎(chǔ)及臨床治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細(xì)胞

實驗動物：清潔級新生SD 大鼠10 只，體重2kg，由內(nèi)蒙古大學(xué)動物飼養(yǎng)中心提供 。

實驗細(xì)胞：神經(jīng)元細(xì)胞購自美國ScienCell 公司。嗅鞘細(xì)胞及成纖維細(xì)胞均在實驗室培養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo 公司)，OLYMPUS BXDX 光學(xué)顯微鏡及顯微照相系統(tǒng)(日本OLYMPUS 公司)，倒置相差顯微鏡(德國Leica 公司)。

細(xì)胞培養(yǎng)器械：Sigma 顯微外科手術(shù)器械、解剖顯微鏡、超凈工作臺、25cm 塑料培養(yǎng)瓶(NUNC 公司)；針頭式濾器(美國Gelman 公司)。

Transwell 細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)(美國Corning 公司)、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(FCS)購自Gibico 公司、多聚賴氨酸(PLL) 、MTT、DMSO 購自sigma 公司、 GFAPIgG、P75 IgG (Santa Cruz 公司)。

1.3 嗅鞘細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和純化

取出生后5d 的SD 大鼠，麻醉后于無菌條件下取材，D-Hanks液漂洗后剪成糊狀，移入離心管中，加入0.125%胰蛋白酶消化，于37℃培養(yǎng)箱，作用25min，用含20%FCS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基作用8min 終止消化，于800rpm 離心5min 去除上清液，再加入無血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基清洗一次，最后用含20%的FCS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基將其制成單細(xì)胞懸液，用火焰拋光后的Pasteur移液管反復(fù)吹打置懸在超凈工作臺內(nèi)，以1×106/mL 的密度將細(xì)胞懸液接種在經(jīng)Poly-L-lysine 處理過的培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3d 后半量換液1 次，再培養(yǎng)2d 用10%FCS的培養(yǎng)基進(jìn)行換液。1-2d 后進(jìn)行純化。

在培養(yǎng)好的嗅鞘細(xì)胞中加入Ara-C 作用36h，作用濃度3umol/L，用DF12 輕 洗2 遍，換10%FCS-DF12 液 培 養(yǎng)3d 后，D-Hanks 液 洗2 次，0.125%的 胰 酶+0.02%EDTA 消 化3-5min，消化時，在倒置相差顯微鏡下觀察，待細(xì)胞突起回縮、胞體變圓，立刻加入純血清終止，其血清終濃度為20%，作用5min。細(xì)胞懸液于800rpm 離心5min，棄上清，用條件培養(yǎng)液(10%FCS+20μmol/L Forskolin+20μg/mL 的BPE+ DF12)置懸細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)瓶中，37°C、5%的CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，30min 后，將培養(yǎng)上清連同未貼壁細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)種。再過30min 重復(fù)上一步驟。24h 后將含未貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液移入15mL 離心管中，取20ul 細(xì)胞懸液用臺盼藍(lán)染色后計數(shù)活細(xì)胞，用10%FCS-DF12 將純化后的嗅鞘細(xì)胞密度調(diào)整為1×106/mL 接種于PLL 預(yù)處理蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。

成纖維細(xì)胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)后備用。

1.4 共培養(yǎng)體系的建立

實驗設(shè)計：嗅鞘細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)組(實驗組)、成纖維細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)組(對照組)。

共培養(yǎng)體系的建立：將第3 代神經(jīng)元細(xì)胞接種于Transwell 培養(yǎng)板底層，24 小時后，在培養(yǎng)板上層裝入小室，同時將第3 代嗅鞘細(xì)胞或成纖維細(xì)胞接種在小室底部，接種濃度均為1×103個/mL。補(bǔ)足培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液完全覆蓋上層小室中的細(xì)胞。Transwell 培養(yǎng)板小室底部的聚碳酸酯膜，可使細(xì)胞貼壁生長，由于膜孔徑只有0.4μm，小室中的細(xì)胞無法通過，而培養(yǎng)液、細(xì)胞生長因子以及小分子物質(zhì)可流通。

1.5 觀測指標(biāo)

細(xì)胞形態(tài)觀察：通過Olympus 倒置顯微鏡動態(tài)觀察不同實驗組神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)及生長情況的變化。

細(xì)胞生長曲線測定：取生長良好的細(xì)胞消化制備單細(xì)胞懸液，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，接種于30 個100mm 培養(yǎng)皿中，每皿接種2mL，置于CO2孵箱進(jìn)行培養(yǎng)，每日取出三個培養(yǎng)皿，0.25%胰酶消化，計算每個培養(yǎng)皿中的細(xì)胞數(shù)，取均值。連續(xù)觀察10 天，以時間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

細(xì)胞代謝活性測定：于細(xì)胞培養(yǎng)第6 天后將2 組共培養(yǎng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元細(xì)胞消化，制備成細(xì)胞懸液，加入到96 孔板中，每孔100μL，細(xì)胞數(shù)在105個左右，孔板加好后，加蓋取出無菌操作臺，在顯微鏡下觀察后在待測細(xì)胞中每孔加濃度為2g/L 的MTT30mL，37℃下孵育6 及12小時后取出，平板離心機(jī)離心后吸去上清，每孔加入100mL 的DMSO，振蕩器上震蕩5min，在酶標(biāo)儀490nm 波長處測定吸光度(OD)值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，組間比較用t 檢驗，P＜0.05 具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

在倒置顯微鏡下可見剛接種的兩組神經(jīng)元細(xì)胞呈圓形或者橢圓形。48 小時后，兩組細(xì)胞均可見細(xì)胞貼壁生長，外觀呈梭形或三角形，細(xì)胞間突起有相互交織。培養(yǎng)的第4 天，實驗組細(xì)胞數(shù)量迅速增長，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞呈三角形或多角形，細(xì)胞間交織成網(wǎng)狀；對照組細(xì)胞數(shù)量有一定增長，細(xì)胞體積稍增大，多數(shù)細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞間部分交織成網(wǎng)狀。第8 天兩組數(shù)量生長均變緩慢，逐步形成細(xì)胞集落，細(xì)胞呈片狀。

圖1 實驗組和對照組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

2.2 細(xì)胞生長曲線

細(xì)胞傳代后第1～3 日為潛伏適應(yīng)期，兩組細(xì)胞均緩慢生長，細(xì)胞數(shù)目逐步增加。

實驗組4日后細(xì)胞數(shù)開始逐步增加，第5～6日開始迅速增加，尤以第6日增加明顯，7日繼續(xù)增加，但增幅減慢，8日后趨于穩(wěn)定，達(dá)到平臺期。

對照組4 日后細(xì)胞數(shù)略有增加，第5～6 日細(xì)胞數(shù)開始明顯增加，第7 日繼續(xù)增加，但增幅減慢，8 日后趨于穩(wěn)定，達(dá)到平臺期。

2.3 細(xì)胞代謝活性測定

有代謝活性的細(xì)胞中加入MTT 培養(yǎng)4h 后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)開始出現(xiàn)藍(lán)色結(jié)晶體，不同時段的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)均可以觀察到濃度不同的藍(lán)色結(jié)晶。實驗組與對照組比色后的OD 值(表1)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 各組MTT 實驗測定值 n=48)

表1 各組MTT 實驗測定值 n=48)

時間(h) 實驗組 對照組 t 值 P 6 0.37±0.02 0.28±0.03 2.51 ＜0.01 12 0.39±0.03 0.16±0.01 3.29 ＜0.01

3 討論

嗅鞘細(xì)胞是一種神經(jīng)支持細(xì)胞，其膜上表達(dá)出很多與細(xì)胞粘合和軸突生長相關(guān)的分子，為再生神經(jīng)建立了很好的內(nèi)環(huán)境。研究證實，嗅鞘細(xì)胞可以分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，這些神經(jīng)生長因子可以保護(hù)殘存的神經(jīng)元，改善脊髓損傷后神經(jīng)元周圍的微環(huán)境，逐步修復(fù)脊髓損傷。

神經(jīng)營養(yǎng)因子是一種大分子的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)主要產(chǎn)生在神經(jīng)元細(xì)胞當(dāng)中，小部分產(chǎn)生在與神經(jīng)相關(guān)的細(xì)胞中，如嗅鞘細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和雪旺氏細(xì)胞等。近年來，也有研究發(fā)現(xiàn)一些神經(jīng)營養(yǎng)因子也可由神經(jīng)元產(chǎn)生，經(jīng)軸漿順向運(yùn)輸?shù)竭_(dá)神經(jīng)末梢，進(jìn)而可調(diào)控突觸后神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)和功能完整性[1]。神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用體現(xiàn)在通過與受體結(jié)合，經(jīng)過軸漿的逆向運(yùn)輸?shù)竭_(dá)胞體，調(diào)節(jié)有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，對神經(jīng)元細(xì)胞的生長、增殖以及部分功能的發(fā)揮起一定作用[2-3]。它的受體主要分為兩種表現(xiàn)形式，其中一種主要表現(xiàn)為較高的親和力(trk)，另外一種表現(xiàn)為較低的親和力(P75NGFR)，這兩種不同親和力的受體都可以使神經(jīng)細(xì)胞突起向NTFs 濃度高的方向生長，從而使神經(jīng)細(xì)胞得到營養(yǎng)作用[4]。神經(jīng)營養(yǎng)因子的主要作用方式是首先與這兩種受體結(jié)合，使細(xì)胞的信號(有關(guān)增殖和凋亡)由細(xì)胞的外部傳遞到細(xì)胞內(nèi)部，從而使細(xì)胞的發(fā)育和凋亡得到調(diào)控。

本實驗結(jié)果顯示在培養(yǎng)第4 天后實驗組細(xì)胞迅速增長，體積增大，細(xì)胞間交織成網(wǎng)狀，在細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)上均優(yōu)于對照組細(xì)胞。通過反應(yīng)細(xì)胞代謝活性的MTT 實驗測試，實驗組與對照組比色后的OD 值，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。神經(jīng)元細(xì)胞的增值、分化等體外生物學(xué)特性受多種因素影響，與嗅鞘細(xì)胞共同培養(yǎng)后生物學(xué)特性的變化的信號通路目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。