劉雅萍，魏昌然，許興超，李湘奇*

(1.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南；3.山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，山東 泰安)

0 引言

近年來乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)已居于我國大中城市惡性腫瘤發(fā)病率首位，嚴(yán)重威脅我國女性的生命健康，且該疾病極易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，癌細(xì)胞擴(kuò)散速度快，部分患者入院診斷時(shí)已發(fā)展為癌癥終末期，患者治療投入大但收效甚微[1]。若能在研究中發(fā)現(xiàn)乳腺癌的診斷指標(biāo)，對患者確診、復(fù)查以及治療效果的評價(jià)等方面均有較大的應(yīng)用價(jià)值，目前臨床檢查中多以腫瘤標(biāo)記物CEA、CA153 和CA125 等為重點(diǎn)，但檢查結(jié)果并不理想[2]。為此，急需尋找靈敏度高的新的標(biāo)志物?，F(xiàn)以2017 年5 月至2019 年6 月來我院進(jìn)行乳腺癌診斷和治療的患者、及良性腫瘤患者為研究對象，對比癌癥患者和良性病變患者病變組織中hMAM 的表達(dá)水平，評價(jià)hMAM 的表達(dá)對診斷乳腺癌的重要意義，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年5 月至2019 年6 月來我院進(jìn)行乳腺癌診斷和治療的患者80 例為觀察組，患者的年齡范圍為32-60 歲，平均年齡為(39.42±6.63)。80 例患者均為浸潤型乳腺癌；臨床分期[3]乳腺癌Ⅰ期18 例，Ⅱ期37 例，Ⅲ期21 例，Ⅳ期4 例；發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移42例。同時(shí)間來院治療的79 例乳腺纖維腺瘤的患者為對照組，患者的年齡范圍為34-66 歲，平均年齡為(43.17±7.22)。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會的認(rèn)可與批準(zhǔn)，所有患者都簽署了知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器

AxyPrep 總RNA 小量制備試劑盒(美國Axygen 公司，貨號：AP-UN-MS-RNA-50)；PrimeScript? RT Master Mix 和SYBR?Premix Ex Taq? II(大連寶生物工程有限公司，貨號：RR036A、RR82LR)；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物科技，貨號：C0105)。

凝膠成像儀(英國UVItec 公司，型號：Alliance Q9)，電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、電泳槽(伯樂Bio-Rad，型號：BE6085)，生物組織自動脫水機(jī)(湖北孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司，型號：TS-12U)，生物組織自動包埋機(jī)(湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司，型號：TB-718D)，Ventana BenchMark XT 全自動免疫組化染色儀(羅氏公司，型號：NexEx IHC)。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR 檢測

依據(jù)AxyPrep 總RNA 小量制備試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞總RNA 的提取。依據(jù)PrimeScript? RT Master Mix 將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(反應(yīng)條件：37℃孵育60min，85℃孵育5min，冰浴5min)。再 通 過PCR 擴(kuò) 增 儀(美 國ABI 公 司，型 號2720 型)和SYBR?Premix Ex Taq? II 試劑盒說明書要求，以cDNA 為模板，進(jìn)行擴(kuò)增：模板1μL、上游引物(10um·μL-1)1μL、下游引物(10um·μL-1) 1μL、2×Taq PCR Master Mix12.5μL、DDH2O 9.5μL，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min 后變性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5min，4℃保存。將β-actin 作為內(nèi)參照。

1.3.2 免疫組織化學(xué)(IHC)檢測

全部標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛進(jìn)行固定處理，并用石蠟進(jìn)行包埋，制成微陣列芯片(孔徑3mm，含40 個(gè)組織芯)4mm 切片；選用2 張用于IHC 染色，另選1 張用于HE 染色；通過磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，嚴(yán)格按試劑盒說明書完成相應(yīng)操作。

1.4 觀察指標(biāo)

RT-PCR 檢測通過凝膠成像系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行分析，以目的基因與內(nèi)參β-actin 的灰度值之比表示mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。

IHC 檢測以高倍鏡觀察下細(xì)胞漿、細(xì)胞膜存在棕色顆粒為hMAM 陽性定義結(jié)果，反之為陰性。隨機(jī)選取高倍視野8 個(gè)，觀察細(xì)胞的染色情況，若無顯色記為0 分，淡黃色記為1 分，棕黃色記為2 分，棕色記為3 分。同時(shí)評價(jià)陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比，陰性：0 分；陽性細(xì)胞在25%及以下記1 分；陽性細(xì)胞數(shù)在25%～50%之間記2 分；陽性細(xì)胞在50%～75%之間記3 分；陽性細(xì)胞在75%～100%之間記4 分。將陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度及其百分比得分相加，其中得分＜3 為陰性，≥3 為陽性[4]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究結(jié)果采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行t 檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差()表示，對統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)，記錄值和P 值，P＜0.05 為結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 2 組hMAM 陽性百分率結(jié)果及其mRNA 表達(dá)水平比較

RT-PCR 檢測結(jié)果表明，觀察組患者病變組織hMAM 陽性百分率、mRNA 表達(dá)水平明顯高于對照組(P＜0.01)，結(jié)果詳見表1，圖1。

表1 2 組hMAM 陽性百分率及其mRNA 表達(dá)水平比較

2.2 乳腺癌組織中hMAM 陽性百分率與臨床病理特征的關(guān)系

以患者的病理分型、病理分期、是否轉(zhuǎn)移為研究指標(biāo)，對乳腺癌患者機(jī)體hMAM 陽性百分率進(jìn)行研究，結(jié)果表明，病理分期處于Ⅲ期～Ⅳ期的患者h(yuǎn)MAM 陽性百分率稍高于處于Ⅰ期～Ⅱ期的患者，但結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.517)；另外，癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移后，hMAM 陽性百分率明顯提高(P＜0.01)，詳細(xì)結(jié)果見表2，圖2。

表2 乳腺癌組織中hMAM 陽性百分率與臨床病理特征的相關(guān)性

圖1 乳腺癌組織及乳腺纖維腺瘤組織中hMAM 的蛋白表達(dá)(SP×200)

3 討論

臨床研究表明，乳腺癌易發(fā)于40～55 歲的中年女性，并且該疾病的發(fā)生可能與患者情緒狀態(tài)、工作壓力有關(guān)[5]。近年來，腫瘤標(biāo)志物的研究逐漸增多，診斷乳腺癌的確切指標(biāo)也越來越多的被發(fā)現(xiàn)，但隨著時(shí)間的改變，乳腺癌的死亡率正逐年增高，成為威脅女性生命最主要的惡性腫瘤，原因主要是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)。仍需要發(fā)現(xiàn)新的有效敏感指標(biāo)來指導(dǎo)提高乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，采取合理的診斷及治療措施，以達(dá)到改善乳腺癌預(yù)后的期望。

圖2 乳腺癌組織及乳腺纖維腺瘤組織中hMAM mRNA 表達(dá)

目前，有關(guān)hMAM 的表達(dá)水平與乳腺癌相關(guān)性的看法尚未明確，但有研究指出，乳腺癌組織中hMAM 的陽性百分率與其發(fā)展存在明顯的相關(guān)性。研究表明，hMAM 與癌變有一定關(guān)系，參與了乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程，說明在癌細(xì)胞分化的初期及晚期，hMAM 的作用極為重要；另外，hMAM 的表達(dá)率在低分化時(shí)顯著高于高分化和中分化，表明hMAM 在癌細(xì)胞分化中后期時(shí)的作用更強(qiáng)[4]。有研究證實(shí)，hMAM mRNA 在乳腺癌原發(fā)灶中其表達(dá)水平明顯高于正常乳腺組織，且hMAM mRNA 的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，但其與組織學(xué)等級或臨床階段之間未觀察到明顯關(guān)聯(lián)[6]。還有研究表明，hMAM mRNA 在乳腺癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平明顯高于乳腺良性腫瘤外周血中hMAM mRNA 的表達(dá)，并且其表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤分期及有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有明顯的相關(guān)性，但與年齡及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移未見明顯相關(guān)關(guān)系[7]。

本研究表明，觀察組患者病變組織hMAM 陽性百分率、mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組；病理分期處于Ⅲ期～Ⅳ期患者h(yuǎn)MAM陽性百分率稍高于處于Ⅰ期～Ⅱ期的患者，但結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；并且癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移后，機(jī)體hMAM 陽性百分率明顯提高。

綜上所述，PCR 技術(shù)和IHC 技術(shù)能快速定量檢測組織中hMAM 的表達(dá)，其靈敏度和特異性高，為此可為乳腺癌的輔助診斷提供客觀可靠的依據(jù)。但是可能由于樣本量較小，雖然得出的結(jié)果與前人研究相符，仍無法確定乳腺癌組織中hMAM 的表達(dá)量是否真的與臨床分期、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等沒有明確關(guān)系，仍需進(jìn)一步的研究。