潘孝成，芮聰杰，2，沈?qū)W懷，趙瑞宏，尹 磊，戴 銀，胡曉苗，侯宏艷，周學(xué)利，張丹俊

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽省畜禽疫病研究中心，畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230031；2.伊寧市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆 伊寧 835000）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一種以水樣腹瀉、脫水、嘔吐為主要特征的急性、高度接觸性腸道傳染病，各個品種和各個年齡階段的豬均易感，尤其對剛出生至10日齡以內(nèi)的哺乳仔豬影響最為嚴(yán)重，表現(xiàn)為高病死率，病死率可高達(dá)100%[1-3]。初生仔豬免疫系統(tǒng)不完善，通過母源抗體獲得被動免疫是預(yù)防仔豬PED的重要方法[4]。PEDV主要侵害被感染仔豬的小腸上皮細(xì)胞，腸道黏膜免疫在抗病毒感染中發(fā)揮著重要的作用，IgA抗體的水平與機(jī)體抵抗PEDV感染的能力正相關(guān)[5-9]。因此建立檢測母豬乳汁中PEDV IgA抗體的間接ELISA方法，開展母豬PEDV免疫水平和效果的有效評估，對PED的防控具有重要的臨床實踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2019年1—5月在安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/安徽省畜禽疫病研究中心進(jìn)行。

1.2 主要材料

PEDV-SD株，安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)研究室分離保存；Vero細(xì)胞、PEDV N蛋白重組質(zhì)粒（pET-28B-N）及PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬口蹄疫病毒（FMDV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）陽性乳汁樣品和PEDV陰性乳汁樣品由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)研究室制備保存；BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自上海生工生物工程有限公司；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）購于索萊寶生物科技有限公司；山羊抗豬IgA-HRP購于Abcam公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天生物科技有限公司；Tween-20購于德國Bio froxx公司；牛血清白蛋白（BSA）購于美國Sigma公司；96孔ELISA包被板購于Corning公司。

1.3 PEDV全病毒純化抗原的制備

將PEDV-SD毒株接種于生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的Vero單層細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到80%時收獲病毒，反復(fù)凍融3次后，收集320 mL病毒液，加入32 mL的Triton X-100，室溫振蕩10 min，6 000 r/min 4℃高速離心20 min，收集上清液，于超速冷凍離心機(jī)45 000 r/min 4℃超速離心120 min，棄去上清液，沉淀用適量0.01 mol/L，pH為7.4的PBS充分溶解，即得豬流行性腹瀉病毒純化抗原，測定抗原濃度后分裝，-80℃冷凍保存。

1.4 PEDV重組N蛋白的制備和鑒定

將pET-28B-N重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3），接于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，250 r/min，37℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至OD600nm值達(dá)到0.4～0.6時，加入0.5 mmol/L的IPTG在15℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)24 h，收集菌液，超聲波裂解，10 000 g離心2 min，收集上清液過鎳柱進(jìn)行純化表達(dá)的重組N蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE分析和Western blot鑒定。收集純化蛋白，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 間接ELISA方法的建立及優(yōu)化

采用方陣滴定法，確定間接ELISA的PEDV N蛋白及純化全病毒兩種抗原的最佳包被濃度（0.5～8 μg/mL），包被液[0.01 mol/L 的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4），0.05 mol/L 的碳酸鹽緩沖液（CBS，pH 9.6）]，抗原包被條件（37℃孵育2 h后4℃16 h、4℃ 16 h、37 ℃孵育 2 h），封閉液的選擇[1%BSA、5%BSA、5%脫脂奶粉（SMP）]，待檢乳汁樣品的稀釋濃度（1∶10～1∶270），待檢乳汁樣品的反應(yīng)時間（15～90 min），山羊抗豬 IgA-HRP 稀釋濃度（1∶5 000～1∶100 000），山羊抗豬IgA-HRP作用時間（15～90 min），TMB顯色時間（5～20 min）。

1.6 臨界值的確定

按以PEDV N蛋白及純化全病毒兩種抗原為包被抗原建立的兩種IgA抗體間接ELISA檢測方法操作，對36份PEDV IgA抗體陰性乳汁樣品進(jìn)行檢測，每份樣品做兩個重復(fù)孔，計算出所檢測陰性樣品OD450nm值的平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)方差（SD）。樣品OD450nm值≥X+3×SD為陽性；樣品OD450nm值≤X+2×SD為陰性；介于兩者之間為可疑。

1.7 敏感性試驗

將PEDV抗體為陽性的乳汁樣品倍比稀釋，按已建立的兩種IgA抗體間接ELISA檢測方法操作測OD450nm，根據(jù)陰陽性臨界值，判斷其陰陽性，確定兩種方法的最低檢測稀釋度。

1.8 特異性試驗

按已建立的兩種IgA抗體間接ELISA檢測方法操作，對本實驗室制備的TGEV、PRV、CSFV、FMDV、PRRSV陽性乳汁樣品進(jìn)行檢測，設(shè)立PEDV陽性和陰性乳汁對照，測OD450nm，根據(jù)陰陽性臨界值，判斷其陰陽性，評估兩種方法的特異性。

1.9 重復(fù)性試驗

選取4份陽性乳汁樣品及1份陰性乳汁樣品，每份樣品做4個重復(fù)，按已建立的兩種IgA抗體間接ELISA檢測方法操作，使用同批次PEDV N蛋白和濃縮純化的全病毒抗原，包被同一批次的酶標(biāo)板，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗，另外包被不同3批次的酶標(biāo)板，進(jìn)行批間重復(fù)試驗。

1.10 臨床樣品的檢測

按已建立的兩種IgA抗體間接ELISA檢測方法操作，對采集自河南、江蘇、安徽地區(qū)的6家開展PEDV免疫的種豬場（免疫次數(shù)為2次或3次）的共計198份母豬初乳樣品進(jìn)行檢測，測OD450nm，根據(jù)陰陽性臨界值，判斷其陰陽性。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)蛋白的分析和純化

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3），誘導(dǎo)表達(dá)后，菌液經(jīng)超聲波裂解，離心后，收集上清液，過親和層析柱純化獲取重組N蛋白，SDS-PAGE分析顯示（圖1A），上清液、沉淀和純化后的產(chǎn)物均出現(xiàn)一條分子量約為58 KDa的條帶，與預(yù)期大小一致，目的蛋白以可溶性表達(dá)為主。利用PEDV陽性血清進(jìn)行Westernblot檢測（圖1B），在目的位置出現(xiàn)明顯的特異性條帶。

2.2 間接ELISA方法的建立及反應(yīng)條件確定

經(jīng)測定純化后的PEDV全病毒和重組N蛋白濃度分別為3.95 mg/mL和1.23 mg/mL，以它們?yōu)榘豢乖?，分別建立檢測PEDV IgA抗體的間接ELISA檢測方法。通過方陣滴定法，確定了最佳反應(yīng)條件（表1）。

表1 間接ELISA檢測方法反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.3 陰陽性臨界值的確定

用本試驗建立的兩種間接ELISA方法分別檢測36份陰性乳汁樣品，結(jié)果顯示，以PEDV全病毒作為包被抗原，樣品OD450nm≥0.431時，判定為陽性；OD450nm≤0.367時，判定為陰性；介于二者之間為可疑。以重組N蛋白為包被抗原，樣品OD450nm≥0.446時，判定為陽性；OD450nm≤0.381時，判定為陰性；介于二者之間為可疑。

2.4 特異性試驗

用本試驗建立的兩種間接ELISA方法在相同的反應(yīng)條件下，分別對TGEV、CSFV、PRV、FMDV、PRRSV陽性樣品進(jìn)行檢測，并設(shè)置PEDV陰陽性乳汁樣品作為對照，結(jié)果顯示（表2），除陽性乳汁樣品外，其余樣品結(jié)果均為陰性，表明本試驗所建立的兩種間接ELISA方法均具有較好的特異性。

表2 間接ELISA特異性檢測結(jié)果

2.5 敏感性試驗

對本試驗建立的兩種間接ELISA方法進(jìn)行敏感性檢測，結(jié)果顯示（圖2），以PEDV全病毒作為包被抗原，當(dāng)陽性乳汁樣品稀釋到1∶960時，仍可檢測為陽性（OD450nm=0.699）；以PEDV重組N蛋白為包被抗原，當(dāng)陽性乳汁樣品稀釋到1∶320時，仍可檢測為陽性（OD450nm=0.485）。說明建立的兩種間接ELISA方法均具有良好的敏感性。

2.6 重復(fù)性試驗

從表3的檢測結(jié)果可以看出，兩種間接ELISA方法的批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均在3.39%～8.87%之間，變異系數(shù)均小于10%，表明本試驗建立的兩種間接ELISA方法均具有良好的可重復(fù)性。

表3 間接ELISA重復(fù)性試驗（n=5）

2.7 臨床樣品的檢測

用本試驗建立的兩種間接ELISA方法，分別檢測198份來自6家種豬場的乳汁樣品，結(jié)果顯示，以PEDV全病毒作為包被抗原，檢測樣本的陽性率為92.93%（184/198）；以重組N蛋白為包被抗原，檢測樣本的陽性率為90.40%（179/198）。兩種方法的檢測符合率為97.48%。

3 討論

本試驗以純化的PEDV全病毒抗原和重組N蛋白作為包被抗原，分別建立了檢測母豬乳汁中IgA抗體的間接ELISA方法，其陽性樣品檢測的最低稀釋度分別是1∶960和1∶320，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于 10%（3.39%～8.87%），與 TGEV、CSFV、PRV、FMDV、PRRSV陽性樣品無交叉反應(yīng)，兩種方法對臨床樣品的檢測符合率為97.48%。說明本試驗建立的兩種檢測PEDV IgA抗體的間接ELISA方法均具有良好的敏感性、重復(fù)性和特異性，能夠用于檢測和評估母豬乳汁中PEDV感染和免疫產(chǎn)生的IgA抗體水平，可為PEDV的感染和免疫效果的評價提供有效的檢測方法。

豬流行性腹瀉雖有多家商品化疫苗上市應(yīng)用，但疫苗免疫對豬流行性腹瀉的控制成效并不顯著，免疫豬場的發(fā)病哺乳仔豬仍呈現(xiàn)高發(fā)病率和高病死率，豬流行性腹瀉目前在我國呈常態(tài)化，仍是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要疫病之一[10]。這種免疫效果不顯著的原因究竟是免疫程序不合理，還是疫苗毒株問題，有待進(jìn)一步分析確定。PEDV主要侵害哺乳仔豬，并造成其大量死亡，特別10日齡內(nèi)仔豬，而斷奶豬和成年豬，雖然也可感染發(fā)病，但大多可康復(fù)[1-2]。大量研究表明，哺乳仔豬主要通過母豬初乳中IgA抗體而獲得PED的被動免疫保護(hù)，因此母源抗體中IgA抗體水平高低對保護(hù)初生仔豬抗PEDV感染極為關(guān)鍵[11-12]。因此，本試驗建立的乳汁中IgA抗體檢測間接ELISA方法，可用于評估PEDV疫苗免疫效果和水平以及免疫程序的合理性，將有助于更好開展PED的防控。