趙 娟，段昌學(xué)，王志俊，劉一飛，王志宇，趙 敏，李正莉，王樹華

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032；2.山西省商洛市動物疾病防控中心，商洛 726000）

仔豬采用早期斷奶技術(shù)能提高母豬繁殖力，但過早斷奶又會因仔豬消化系統(tǒng)不健全等易出現(xiàn)仔豬早期斷奶綜合征[1]，表現(xiàn)為食欲降低、消化不良、飼料利用率低、抗病力下降、腹瀉等癥狀，斷奶仔豬腹瀉是集約化生產(chǎn)條件下的一種典型的多發(fā)性疾病。據(jù)調(diào)查，在我國，斷奶仔豬腹瀉率高達50%～60%，死亡率高達20%，在斷奶10～15 d高發(fā)，該病流行面廣，終年發(fā)病，病愈的仔豬也常生長緩慢，飼料報酬降低，導(dǎo)致生長抑制，甚至出現(xiàn)僵豬或死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失[2]。

目前，系統(tǒng)觀察斷奶仔豬小腸超微病變的研究仍較少，所以本試驗采用中藥和抗生素治療斷奶仔豬腹瀉，通過腸黏膜病理切片染色及電鏡包埋切片觀察中藥對斷奶腹瀉仔豬小腸黏膜的影響[3]，腸道微絨毛腸上皮間淋巴細胞（LELs）、杯狀細胞（GSs）及上皮細胞內(nèi)細胞器的病變，闡述了中藥復(fù)方顆粒劑對斷奶腹瀉仔豬小腸黏膜的影響，以期能在養(yǎng)豬生產(chǎn)中阻斷斷奶仔豬腹瀉的愈后不良，為防治斷奶仔豬腹瀉、提高斷奶仔豬的生長性能及現(xiàn)代養(yǎng)豬場中以中藥替代抗生素作為添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥復(fù)方顆粒劑制備 中藥復(fù)方由黃芪、黨參、炒白術(shù)、炒山楂、炒麥芽、炒神曲、淮山藥、干姜、茯苓、甘草等13味中藥組成（原材料購自山西省醫(yī)藥公司），由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所中獸醫(yī)藥研究室研制，山西省中醫(yī)研究所煎制。

1.1.2 抗生素的配制 廣譜抗生素鹽酸林可霉素購自一心堂，用pH 7.4的生理鹽水配制成濃度為100 mg/mL，待用。

1.1.3 試驗動物 選用18頭（28±1）d、體重10.04 kg左右的杜長大三元雜種斷奶腹瀉仔豬。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗于2019年5月12日至9月27日在太原市小店區(qū)南郊繁峙砂鎮(zhèn)的宏利豬場進行。試驗將18頭斷奶腹瀉仔豬隨機分為2組，每組3個重復(fù)，Ⅰ組為抗生素治療組，Ⅱ組為中藥復(fù)方顆粒劑治療組，分別于用藥后14 d時，每組隨機抽取3頭，頸動脈放血處死，腹腔解剖觀察病理變化，無菌采集小腸黏膜。

1.2.2 腸壁光學(xué)顯微鏡組織學(xué)觀察 觀察各組仔豬小腸黏膜病理組織學(xué)變化：取十二指腸、回腸各5 cm腸組織剖開，用生理鹽水沖洗后，在4%福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋，并制成5 μm厚的切片，用常規(guī)HE（蘇木-伊紅）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察小腸黏膜出血、黏膜脫落及炎性細胞浸潤情況（趙娟等，2011）。

1.2.3 腸壁電子顯微鏡細胞學(xué)觀察 觀察各組仔豬小腸黏膜在電鏡下的形態(tài)：分別取十二指腸、回腸1～2 cm組織，經(jīng)過生理鹽水清洗后，切成1 mm大小顆粒，放入2%戊二醛固定2 h后，經(jīng)脫水包埋于環(huán)氧樹脂中，并切成80 nm厚的超薄切片，枸櫞酸鉛染色，電鏡下觀察，小腸絨毛排列，細胞受損狀況及細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等的病變情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 解剖病理學(xué)變化

抗生素治療組仔豬十二指腸至回腸充血，出血，小腸內(nèi)食糜呈稀便，腸系膜淋巴結(jié)充血，出血和水腫，黏膜脫落，有大量炎性細胞，嗜酸性粒細胞及淋巴細胞浸潤。中藥復(fù)方顆粒劑治療腹瀉仔豬小腸除局部可見輕微充血、出血外，腸黏膜基底部完整，未發(fā)現(xiàn)明顯病理變化。

2.2 腸壁光學(xué)顯微鏡組織學(xué)觀察結(jié)果

2.2.1 小腸壁炎性細胞浸潤程度 抗生素治療組仔豬小腸絨毛內(nèi)皮以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤明顯，且炎癥細胞已達固有層及黏膜下層（圖1A），表明炎癥細胞范圍較大。而中藥治療組腹瀉仔豬的小腸絨毛上皮內(nèi)僅有少許淋巴細胞及其他炎癥細胞浸潤，在固有層及黏膜下層未見有淋巴細胞浸潤（圖1B）。

2.2.2 小腸黏膜上皮細胞脫落程度 抗生素治療組仔豬十二指腸至回腸的小腸黏膜上皮細胞變性、壞死，腸腔中有脫落的上皮細胞和紅細胞，小腸黏膜基底部廣泛充血、出血，小腸絨毛杯狀細胞擴張、增生（圖2A）。而中藥復(fù)方顆粒劑治療組斷奶腹瀉仔豬有個別小腸絨毛上皮細胞發(fā)生變性，其余未見異常（圖2B）。

2.2.3 固有層和黏膜下層病變 光鏡下觀察到抗生素治療仔豬的小腸固有層和黏膜下層充血、出血和水腫，腸腺細胞發(fā)生變性、壞死、間質(zhì)水腫，淋巴細胞浸潤、增生、淋巴小結(jié)增大（圖3A、圖3C）。而中藥復(fù)方顆粒劑治療組仔豬的小腸絨毛排列整齊，長短基本一致，無明顯炎癥細胞浸潤（圖3B、圖3D）。

2.3 腸壁電子顯微鏡細胞學(xué)觀察結(jié)果

2.3.1 腸壁杯狀細胞電鏡切片 中藥復(fù)方顆粒劑治療組的杯狀細胞膜完整（因發(fā)育時期不同，所以沒有細胞核），線粒體完整，嵴完整，核膜完整（圖4A、圖4B）。而抗生素治療組的杯狀細胞核物質(zhì)外泄，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡化，線粒體腫脹空泡化，嵴缺失，排列紊亂（圖4C）。

2.3.2 腸壁淋巴細胞和吸收細胞電鏡切片 中藥治療組的淋巴細胞健康完整，細胞核膜完整，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)健康完整（圖5A）。而抗生素治療組的淋巴細胞核膜腫脹呈彌散狀，核物質(zhì)外泄，異染色質(zhì)凝聚于內(nèi)膜邊緣，明顯呈病理性狀態(tài)（圖5B）。

2.3.3 腸道微絨毛電鏡切片 中藥治療組小腸微絨毛排列緊密，上皮絨毛細胞微絨毛排列整齊，微絨毛平整，有規(guī)律排列，微絨毛下方可見完整的緊密連接復(fù)合體及肌動蛋白，腸上皮細胞內(nèi)側(cè)可見到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（圖6A）。而抗生素治療組腸上皮細胞微絨毛倒伏狀，脫落明顯（圖6B）。

2.3.4 腸道菌及溶酶體電鏡切片 中藥復(fù)方顆粒劑治療組腸道菌已被溶酶體吸收并逐漸消化（圖7A）。而抗生素治療組的腸道菌依然有許多附著在腸道管壁上（圖7B）。

2.3.5 腸壁淋巴細胞電鏡切片 中藥復(fù)方顆粒劑治療組淋巴細胞健康完整，細胞核膜完整，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)健康完整（圖8F）。而抗生素治療組的淋巴細胞呈各種病理性變化，線粒體腫大、嵴缺失（圖8A），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹明顯（圖8B），核糖體脫落（圖8C），細胞膜、細胞核破裂，核物質(zhì)外泄（圖8D），并有呈雙核仁或核萎縮的淋巴細胞（圖8E）。

3 討論

本研究結(jié)果表明，抗生素治療仔豬腹瀉，嚴重破壞仔豬腸黏膜病理組織學(xué)結(jié)構(gòu)及腸黏膜細胞學(xué)結(jié)構(gòu)，影響仔豬的消化吸收及免疫功能，因此，抗生素對治療仔豬腹瀉雖具有一定效果，但也是形成僵豬的重要原因。而中藥治療有效改善腸黏膜組織結(jié)構(gòu)，修復(fù)腹瀉仔豬腸黏膜的吸收功能和免疫功能，為腹瀉仔豬的康復(fù)治療提供更為有效的方法。

有研究結(jié)果表明，胰高血糖素樣肽-2（GLP）對28日齡斷奶仔豬的腸黏膜上皮細胞的損傷有增殖作用，影響上皮細胞代謝并對其完整性有修復(fù)作用[4]。仔豬28日齡斷奶，腸道黏膜淋巴細胞含量最高，而斷奶越早，仔豬腸黏膜中杯狀細胞數(shù)量顯著升高（P<0.05）[5]。新生犢牛小腸黏膜結(jié)構(gòu)隨著日齡增加，小腸絨毛變短，黏膜層厚度增加，小腸各段上皮細胞內(nèi)淋巴細胞和杯狀細胞隨年齡增長而逐漸增多。相同日齡，從十二指腸至回腸，上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量逐漸減少，而杯狀細胞數(shù)量呈增多趨勢[6]。腸應(yīng)激綜合征患者小腸與結(jié)腸黏膜內(nèi)杯狀細胞、漿細胞、肥大細胞等超微結(jié)構(gòu)的改變在疾病發(fā)生機制中有一定的作用[7]。肉仔雞飼糧中添加丁酸鈉，能增加小腸黏膜中肥大細胞，上皮內(nèi)淋巴細胞及杯狀細胞的數(shù)量[8]。金光明等研究表明，中藥提取物對肉仔雞小腸黏膜免疫具有明顯的促進作用[9]。肉兔飼糧中添加1%的銀杏葉復(fù)方制劑，可維持和養(yǎng)護斷奶肉兔的小腸黏膜組織[10]。中藥復(fù)方制劑對仔豬腸道中大腸埃希菌具有明顯的抑制作用，并能顯著提高仔豬腸道中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量，改善腸道微生態(tài)環(huán)境，提高仔豬的生長性能[11]。

在本試驗中，通過中藥復(fù)方顆粒劑對腹瀉仔豬的治療，可明顯改善腸黏膜、受損淋巴細胞、杯狀細胞的細胞結(jié)構(gòu)，與上述文獻結(jié)果相近。研究發(fā)現(xiàn)斷奶仔豬腸黏膜系統(tǒng)不夠健全，黏膜免疫力低下，很容易誘發(fā)各種胃腸道疾病，引起腹瀉[12]，而用抗生素治療時會造成仔豬腸黏膜破壞及腸道菌群紊亂等，影響仔豬消化吸收及免疫功能，給現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失。而中藥具有標本兼治的特點，可以從根本上去除病因而達到抗生素所不能達到的治療效果，并可糾正因濫用抗生素而引起的耐藥性等不良反應(yīng)。有研究顯示，母豬的奶主要由脂肪（40.6 g/100 g）、蛋白質(zhì)（29.4 g/100 g）和乳糖（28.3 g/100 g）組成。母乳中的乳糖在乳糖酶的作用下轉(zhuǎn)變成豐乳糖和葡萄糖，母乳中的蛋白質(zhì)分解成氨基酸。葡萄糖和氨基酸可作為上皮細胞的主要能量來源，另一方面中藥中的多糖也可作為上皮細胞的主要能量來源[13-14]，中藥的蛋白質(zhì)中，一些氨基酸除了合成蛋白質(zhì)外，也可作為上皮細胞的能量來源，促進腸黏膜的發(fā)育與成熟，促進腸黏膜細胞的修復(fù)，從根本上解決仔豬腹瀉的發(fā)生，對早期斷奶仔豬腹瀉引起的腸黏膜損傷有顯著的修復(fù)作用。