盧冰霞，周英寧，梁家幸，秦毅斌，陳忠偉，何 穎，趙 碩，蔣冬福，李 斌，段群棚，劉 磊，3，趙 武

（1.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530001；2.廣西大學，南寧 530005；3.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，南寧 530007）

現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)不斷向規(guī)模化、集約化的方向發(fā)展，但伴隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，動物疫病也愈發(fā)復雜，已成為限制養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的重要因素。養(yǎng)殖業(yè)為了“防病治病”，大量濫用抗生素的現(xiàn)象十分普遍[1]?？股貫E用會引起細菌耐藥性增強、免疫抑制、藥物殘留等一系列問題，嚴重威脅養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和人類的健康。研究開發(fā)抗生素替代品、推廣使用綠色添加劑是當前研究的熱門，也是未來研究的方向[2]。益生菌是一類有益于宿主的活性微生物的總稱，它們定植于動物腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能夠發(fā)揮改善宿主微生物生態(tài)平衡、促進營養(yǎng)吸收等有益作用。益生菌以其安全、增強免疫力、促進生長、抑制病原菌等優(yōu)勢，作為理想的抗生素替代品而被廣泛應用[3-5]。芽孢桿菌是一種好氧的革蘭氏陽性菌，有芽孢，能夠耐高溫、耐酸且方便保存，是當前應用廣泛的一種益生菌[6]?？莶菅挎邨U菌是芽孢桿菌的一種，因具有改善消化道內(nèi)環(huán)境、促生長、提高免疫力及生產(chǎn)多種酶類或提高消化酶活性等功能而廣泛應用[7]。雖然市面上也有較多商品化的添加于豬飼料中的枯草芽孢桿菌，但源于動物尤其是來源于豬的枯草芽孢桿菌益生菌菌種鮮見報道。非動物來源的枯草芽孢桿菌在動物腸道中定殖力難，無法發(fā)揮其生物活性[8-9]，因此開展動物源益生菌的篩選與研發(fā)十分必要。本研究從某規(guī)模豬場健康豬的新鮮糞便中分離鑒定獲得1株枯草芽孢桿菌，并研究其部分生物學特性及其益生性能，為下一步鑒定其是否能成為益生菌候選菌株奠定基礎，也為進一步研究與開發(fā)畜禽微生態(tài)制劑提供菌種資源和理論依據(jù)及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品與試驗動物

試驗于2019年6月10日至2020年4月2日在廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所進行。健康仔豬的新鮮糞便，采自廣西某規(guī)?；B(yǎng)豬場；6周齡健康小鼠，體重18～22 g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）購自北京陸橋技術(shù)有限公司；豬膽鹽購自北京索萊寶科技有限公司；革蘭氏染液、芽孢染液、生理生化試劑，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；DNA抽提試劑盒為Axygen生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 菌株的分離鑒定

1.3.1 樣品采集 采集健康仔豬新鮮糞便，按照1∶5的比例使用無菌的PBS混勻后，于85℃水浴加熱20 min，取1 mL上清液進行10倍系列的梯度稀釋，得到10-1～10-4一系列不同濃度的菌源稀釋液。

1.3.2 菌株的分離 無菌吸取上一步驟各稀釋度的菌源稀釋液接種于TSA平板的表面，每個平皿接種3個稀釋度，每組設3個重復，37℃靜置培養(yǎng)24 h。

1.3.3 分離菌的純化 挑取步驟1.3.2中的單菌落，劃線接種TSA平板37℃培養(yǎng)24 h，重復劃線接種培養(yǎng)3次，得到純的分離菌。選取菌落形態(tài)典型的單個菌落加入4 mL TSB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，得到的培養(yǎng)物擴大培養(yǎng)后用于下面的鑒定和益生特性研究。

1.3.4 分離菌培養(yǎng)特性與形態(tài)觀察 取10 μL純培養(yǎng)的菌液，用適量生理鹽水稀釋后涂片，進行革蘭氏染色和芽孢染色，顯微鏡下觀察細菌染色情況及形態(tài)特征。

1.3.5 分離菌生理生化鑒定 對分離獲得的菌株進行接觸酶試驗、明膠液化、V-P試驗、淀粉水解試驗、硝酸鹽還原試驗、卵磷脂酶試驗、7%氯化鈉試驗、檸檬酸鹽試驗、葡萄糖試驗、甲基紅試驗、丙酸鹽試驗及運動性檢驗試驗等，根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊》（9版）對分離菌的種屬進行初步鑒定。

1.3.6 分離菌分子生物學鑒定 按照DNA抽提試劑盒中的方法提取分離菌DNA。以分離菌的DNA作為模板，PCR擴增其16S rDNA序列。PCR引物為擴增細菌16S rDNA的通用引物，序列為：27F 5'-AG AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和1492R 5'-TACGGY TACCTTGTTACGACTT-3'（由上海生物工程有限公司合成），擴增目的片段長度約1 500 bp。采用25 μL PCR反應體系：2xF8FastlongPCR MasterMix 12.5 μL，25 μmol/L 上、下游引物各 0.5 μL，滅菌水 8.5 μL，模板 3.0 μL。反應程序為：94 ℃ 3 min，94 ℃ 10 s，退火溫度10 s，72℃ 10 s，30個循環(huán)；72℃最后再延伸10 min。取10 μL PCR擴增產(chǎn)物于1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳并觀察結(jié)果。

將陽性PCR產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進行序列測序，再利用生物學軟件Meglin對測序所得序列進行核苷酸同源性比對分析，并運用MAGA 7.0進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，確定分離菌株的類別。

1.4 分離菌的益生特性研究

1.4.1 耐酸性研究 用0.1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)TSB培養(yǎng)基 pH 為 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 和 4.0（每個 pH 3 個重復，每個重復1個樣品），分別按1∶100加入純化的分離菌，37℃處理4 h后取菌懸液，用涂抹平板法計數(shù)，以自然pH下的菌懸液為對照，37℃培養(yǎng)24 h，分別計算存活率。存活率（%）=[1－（對照組含菌量－不同條件處理后含菌量）/對照組含菌量]×100%。

1.4.2 耐膽鹽性研究 TSB培養(yǎng)基加入豬膽鹽使其質(zhì)量分數(shù)為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%，滅菌后分別按1∶100加入純化的分離菌，37℃培養(yǎng)24 h，以不加豬膽鹽的培養(yǎng)基作為對照組，每種濃度3個重復，每個重復1個樣品。用涂平板法計活菌數(shù)。1.4.3 耐熱性能研究 取純化的分離菌（每個溫度1 mL） 分別置于 70、75、80、85、90 和 95 ℃的水中放置10 min，取出冷卻至室溫，用涂抹平板法計數(shù)，以室溫下的菌懸液為對照組。每個處理溫度3個重復，每個重復1個樣品。

1.5 抗致病菌活性測定

致病菌為本實驗室保存的豬源大腸桿菌和沙門氏菌，采用牛津杯法進行抗致病菌測定試驗。分別取100 μL大腸桿菌和沙門氏菌到兩個TSA平板上，用三角形涂布器涂布均勻，將6個牛津杯均勻插在TSA平板的瓊脂里，然后在每個牛津杯中加入200 μL純化的分離菌，37℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈的直徑大小。

1.6 分離菌的藥敏試驗

采用K-B紙片擴散法，取100 μL純化的分離菌（濃度約為1.0×108CFU/mL）涂布于TSA平板上，靜置5 min后，用鑷子將藥敏紙片均勻貼到瓊脂表面（每個平板貼9種藥物），37℃倒置培養(yǎng)過夜，判斷標準按2010版CLSI M100-S20執(zhí)行。

1.7 動物安全性試驗

將小鼠分為2組，每組5只，第1組為試驗組，第2組為對照組。試驗組分別喂服純化的分離到的菌株（濃度約為 1.0×108CFU/mL，按 1∶10 稀釋，注入飲水混勻），2次/周；對照組喂服生理鹽水。觀察小鼠的狀態(tài)，記錄小白鼠的發(fā)病、死亡等情況，試驗時間為4周。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株形態(tài)特征及染色結(jié)果

在TSA平板上從健康仔豬糞便中分離培養(yǎng)出多株分離菌，經(jīng)過多次連續(xù)劃線培養(yǎng)，分離到多個純化的菌落。選取生長快速、形態(tài)特征好的一株優(yōu)秀菌進行擴大培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗。分離菌在TSA平板上呈乳白色，不透明，邊緣不規(guī)則，表面有褶皺，容易挑起（圖1）。革蘭氏染色后鏡檢，菌體形態(tài)呈長桿狀，革蘭氏陽性菌（圖2），芽孢染色呈綠色，芽孢所占比例較大，基本位于一側(cè)（圖3）。符合芽孢桿菌的特征。

2.2 分離菌生理生化鑒定結(jié)果

生化試驗結(jié)果表明，分離菌株能發(fā)酵蔗糖、麥芽糖、果糖、甘露醇和葡萄糖，能水解淀粉，甲基紅試驗、接觸酶試驗、明膠液化試驗、V-P試驗、硝酸鹽還原試驗和檸檬酸鹽試驗均為陽性，依據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊》（9版）可初步鑒定分離菌為芽孢桿菌屬，命名為Y1，分離菌Y1的部分生理生化結(jié)果見表1。

表1 分離菌生理生化試驗結(jié)果

2.3 分離菌Y1分子生物學鑒定結(jié)果

分離菌Y1 PCR擴增產(chǎn)物目的片段大小約為1 500 bp（圖4），對分離菌Y1的16S rDNA測序序列用生物學軟件Meglin進行序列核苷酸同源性比對分析。分析結(jié)果表明，與枯草芽孢桿菌序列同源性為99.60%～100%。利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建遺傳進化樹，結(jié)果顯示，分離菌Y1與枯草芽孢桿菌（MH210872.1和DQ444283.1）親緣關系最近，在同一進化樹分支上（圖5）。

2.4 分離菌Y1部分益生特性研究結(jié)果

2.4.1 耐酸性 從圖6可見，分離菌Y1在pH為1.0～5.0的TSB培養(yǎng)基中37℃處理4 h后進行計數(shù)，隨著pH的降低，分離菌Y1的存活率也降低，當pH為2.0時，存活率平均值仍能達到82.7%。當pH為1.0時，存活率明顯降低，表明超低pH對分離菌Y1的活性有較大影響，但其存活率平均值仍能達到28.2%，表明分離菌Y1具有較強的耐酸性能。

2.4.2 耐膽鹽性 從圖7可見，分離菌Y1在不同含量豬膽鹽的TSB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h后進行計數(shù)，結(jié)果顯示，其存活率隨著豬膽鹽質(zhì)量分數(shù)的增加而下降，但濃度為0.6%時存活率平均值仍能達到60.5%，表明分離菌Y1具有較強的耐膽鹽性能。

2.4.3 耐熱性 從圖8可見，分離菌Y1在70、75、80、85、90和95℃的水浴中放置10 min后再進行計數(shù)，結(jié)果表明分離菌Y1具有一定的耐熱性能，存活率隨著水浴溫度的增加而下降，80℃以下存活率很高，存活率平均值在94.5%以上，85℃以上存活率下降快，95℃時的存活率平均值為19.8%，表明分離菌Y1具有較強的耐高溫性能。

2.5 抗致病菌活性測定結(jié)果

牛津杯法測定結(jié)果為：分離菌Y1抑制大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑平均值分別為14.56 mm和18.29 mm，說明分離菌Y1能夠一定程度地抑制病原菌大腸桿菌和沙門氏菌的生長，且抑制沙門氏菌的效果略好于抑制大腸桿菌的。

2.6 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果顯示，分離菌Y1對試驗用大部分抗生素較敏感，如對大觀霉素、阿奇霉素、慶大霉素、強力霉素等；對頭孢唑啉、阿莫西林、桿菌肽、鏈霉素等藥物中度敏感；僅對青霉素G、土霉素和金霉素耐藥。具體結(jié)果見表2。

表2 分離菌Y1藥敏試驗結(jié)果

2.7 動物安全性試驗結(jié)果

試驗組小鼠與對照組相比，試驗期間均采食正常、精神良好，無一死亡，說明分離到的枯草芽孢桿菌具有良好的安全性。

3 討論

動物的消化道是獲取益生菌菌種的重要來源之一[9]。本試驗從臨床健康仔豬的糞便中獲得多株芽孢桿菌，選取其中1株生長快速、形態(tài)特征典型的菌株進行研究。其形態(tài)特征、生理生化及分子生物學鑒定結(jié)果與鐘羅華等[1]、魏珊珊等[10]報道的研究結(jié)果相符，確定該分離菌為枯草芽孢桿菌，并對其益生特性進行研究，評價其作為畜禽微生態(tài)制劑菌種的潛在價值。

因芽孢桿菌具有改善動物腸道微生態(tài)平衡、促進動物生長、提高免疫力和減少相關疾病和安全等多重益生功效，已然是當前動物飼料中應用最廣泛的一種益生菌[7]。章文明等[11]的研究表明，飼喂與動物同源的益生菌才能使其更好地定殖于動物腸道內(nèi)并搶奪附著點而發(fā)揮益生效應。同時，同源性菌株還應具有安全性高、免疫原性低等優(yōu)點，才能作為微生態(tài)制劑的益生菌株。因此安全、高效同源益生菌的篩選和培育研究開發(fā)飼用益生菌添加劑是研究重點[12]。飼料中添加的益生菌要想定殖于腸道而發(fā)揮其益生作用，必須能經(jīng)受住胃中惡劣的強酸性環(huán)境和十二指腸中膽汁的破壞[6]。本試驗分離獲得的枯草芽孢桿菌菌株耐酸性試驗表明，其經(jīng)pH 2.0的TSB處理4 h后，存活率平均值仍能達到82.7%，表明菌株具有較好的耐酸特性。分離菌菌株耐膽鹽試驗表明，在含0.6%豬膽鹽的TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，其存活率平均值仍能達到60.5%，表明其具備較強的耐膽鹽性能，為其進入動物機體后耐受腸道內(nèi)膽鹽的破壞提供了保障。分離菌其良好的耐酸性和耐膽鹽特性為其益生作用奠定了基礎。分離菌菌株耐熱試驗表明，分離菌在90℃的水浴中放置10 min后，其存活率平均值仍能達到54.5%，表明分離菌具有較強的耐熱性能，符合飼料加工工藝的要求。對致病菌的抑制作用試驗表明，分離菌能夠一定程度地抑制病原菌大腸桿菌和沙門氏菌的生長，對豬腸道可以起到一定的保健作用。分離菌藥敏試驗結(jié)果表明，分離菌對試驗用大部分抗生素較敏感，僅對青霉素G、土霉素和金霉素耐藥，可能是豬場長期使用或者在飼料中添加這3種抗生素，導致分離的枯草芽孢桿菌對其耐藥。此外，動物試驗表明分離菌對試驗小鼠無毒副作用，具有較好的安全性。綜上所述，本試驗分離得到的枯草芽孢桿菌符合作為益生菌候選菌株的必要條件，可成為畜禽微生態(tài)制劑的供試菌株，為進一步研究與開發(fā)畜禽微生態(tài)制劑提供菌種資源和理論依據(jù)及技術(shù)支持。

4 結(jié)論

本試驗從健康仔豬新鮮糞便中分離獲得一株細菌，根據(jù)形態(tài)特征、生化及分子生物學鑒定，確定該分離菌為枯草芽孢桿菌。該分離菌具有如下優(yōu)勢：菌株菌落大，生長快速，耐85℃以上熱處理，耐酸（pH為2.0）處理，耐0.6%豬膽鹽處理。同時具有一定的拮抗致病菌的作用，對大部分抗生素敏感，具有作為優(yōu)良益生菌候選株的優(yōu)勢。本試驗豐富了豬源枯草芽孢桿菌益生菌菌種候選資源，為畜禽益生菌制劑的研發(fā)提供了優(yōu)質(zhì)候選供試菌株。

銅鍍層能殺滅新冠病毒

【澳大利亞《悉尼先驅(qū)晨報》網(wǎng)站4月15日報道】題：鍍銅門把手能殺死新冠病毒？科學家說，有道理（記者 利亞姆·曼尼克斯）

鍍銅門把手成了全球抗疫的最新武器。

墨爾本一家三維打印公司目前已在多處政府設施和大學安裝了銅門牌和銅門把手，但科學家稱應擴展到醫(yī)療設施和各公共場所。

銅具有廣泛的抗微生物特性，且已安裝在全球的一些醫(yī)院，以阻止對抗生素具有耐藥性的超級細菌的傳播。初步證據(jù)顯示，銅還可以摧毀新冠病毒（SARS-CoV-2）。

澳大利亞弗林德斯大學一個實驗室的負責人巴特·艾克爾坎普博士在研究銅的特性，他說：“眾所周知，銅具有抗微生物的特性，已用于醫(yī)療設備的抗微生物涂層?！?/p>

他說：“將之轉(zhuǎn)化為更廣泛的用途，比如床欄桿和扶手，似乎是非常合乎邏輯的，可能會有幫助。”

澳大利亞總理斯科特·莫里森說，正在討論取消限制。但他重申，由于擔心之后會暴發(fā)新冠疫情，解禁尚需幾周的時間。

3月在美國《新英格蘭醫(yī)學雜志》周刊上發(fā)表的一項小型研究檢測了各種物質(zhì)表面的新冠病毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銅表面的病毒會很快變得不穩(wěn)定。

打印銅門器具的澳大利亞“速度”三維打印機公司委托墨爾本的一家病毒實驗室進行研究，結(jié)果表明，銅在兩個小時內(nèi)將病毒數(shù)量減少了96%。

悉尼大學病毒存活專家漢納·薩西博士說：“我們已經(jīng)知道銅具有抗微生物的特性，對醫(yī)院的很多病原體非常有效?！?/p>

2013年在多家醫(yī)院進行了一項隨機對照實驗，檢測醫(yī)院房間內(nèi)的銅床欄桿、桌子和椅子扶手。鍍銅表面將醫(yī)院獲得性感染的風險減少了一半以上。

另一方面，不銹鋼似乎是SARS-CoV-2的“良港”。在《新英格蘭醫(yī)學雜志》發(fā)表的這項實驗中，不銹鋼表面72小時后仍可檢測到病毒。

公共衛(wèi)生專家正在考慮疫情期間健身房是否應該一直關閉，因為里面通常都是不銹鋼器械。

“速度”三維打印機公司的首席執(zhí)行官拜倫?？夏岬险f：“不銹鋼看著真的很干凈。事實完全不是這樣。它不會殺死病毒。我們的測試長達5個小時，不銹鋼表面的病毒數(shù)量根本沒有減少?！?/p>

該公司向汽車和航空工業(yè)以及軍方出售三維金屬打印設備。隨著新冠疫情大流行，肯尼迪及其團隊已研究出方法，利用三維打印機為現(xiàn)有的門把手涂上一毫米厚的銅鍍層。

每次鍍銅的花費約為50到100美元，大約需要5分鐘。

銅似乎有多種特性，可以殺死病毒。當細菌或病毒落到銅表面，帶電粒子，即離子，會從銅表面跳到細菌上，對細菌穿孔然后消滅它。

銅似乎還對細菌有一系列其他的負面影響，包括破壞其DNA。

（轉(zhuǎn)自 參考消息[N]，2020-04-17）